| 查看: 1848 | 回复: 9 | |||
[交流]
【求助/交流】长片段的连接转化已有6人参与
|
|
最近在做一个长片段的连接，载体4.5kb，片段7kb，做了好多次都没结果，转化大肠杆菌，化转电转都有尝试。 连接应该没有问题，能够连上，觉得主要原因在于转化，第一，感受态效率不高，第二，开环状态不容易进去， 请教长片段连接的注意事项，或是分享连接成功的经验，谢谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有179人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
为什么最近做连接转化总是失败
已经有20人回复- 请教一下连接与转化问题！
已经有11人回复
- 连接转化不成功问题
已经有17人回复
- 目的片段与表达载体的连接
已经有23人回复
- BAC文库连接转化
已经有22人回复
- 目的片段和T1载体连接后转入感受态细胞涂板子总不长菌……
已经有7人回复
- 转化连接遇到的奇怪的事！
已经有3人回复
- 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题
已经有10人回复
- 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】目的片段与pYD1好连接吗，转化DH5a容易吗
已经有4人回复
- 【求助/交流】请教连接转化方面的问题
已经有14人回复
- 【求助/交流】超大片段连接问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】大片段连接转化成功与否问题
已经有11人回复
srlee
铁杆木虫 (小有名气)
- MolEPI: 7
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 4485.7
- 散金: 17
- 红花: 3
- 帖子: 218
- 在线: 508.4小时
- 虫号: 802845
- 注册: 2009-07-03
- 专业: 生物防治
★ ★
1949stone(金币+2):学习交流 2010-06-06 23:30:50
wwdxx2004(金币+2):谢谢 2010-06-07 10:16:08
wwdxx2004(金币+2): 2010-06-09 22:36:13
1949stone(金币+2):学习交流 2010-06-06 23:30:50
wwdxx2004(金币+2):谢谢 2010-06-07 10:16:08
wwdxx2004(金币+2): 2010-06-09 22:36:13
|
前一段时间也做了大片段连接，开始也总是没有转化子出现，电转化时还经常爆杯，后来用一个连接试剂盒终于做成功了。 我觉得连接注意的事项主要有：（1）首先载体去磷酸化，可以提高连接效率。（2）合适的载体DNA和插入DNA的浓度比也很重要。（3）载体和插入片段制备好后最好及时连接，以保证新鲜度。（4）连接完成后失活连接酶，可以提高转化效率。（5）制备较高效率的化感及电感受态细胞。（6）连接完成后添加合适的量至感受态细胞中，过量也会造成转化效率不高。（7）还有就是，涂板时用的平板最好是新鲜的，不要放置过久。不然平板容易干涂布时不易涂匀，并且抗性也会变得很差，影响阳性克隆出现。 以上仅供参考，实验做得多了也就有经验了，慢慢来，祝实验顺利！ [ Last edited by srlee on 2010-6-7 at 00:00 ] |
2楼2010-06-06 22:05:34
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 7
- 应助: 1 (幼儿园)
- 贵宾: 0.021
- 金币: 7298.5
- 散金: 9
- 红花: 13
- 帖子: 4032
- 在线: 224.7小时
- 虫号: 551611
- 注册: 2008-04-27
- 性别: GG
- 专业: 神经系统肿瘤（含特殊感受
3楼2010-06-06 23:53:36
4楼2010-06-07 10:18:11
srlee
铁杆木虫 (小有名气)
- MolEPI: 7
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 4485.7
- 散金: 17
- 红花: 3
- 帖子: 218
- 在线: 508.4小时
- 虫号: 802845
- 注册: 2009-07-03
- 专业: 生物防治
5楼2010-06-07 17:08:38
6楼2010-06-07 19:19:02
7楼2010-06-07 20:48:51
空谷幽风
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 32
- 应助: 13 (小学生)
- 贵宾: 0.05
- 金币: 1106.1
- 散金: 500
- 红花: 13
- 帖子: 615
- 在线: 116.5小时
- 虫号: 714271
- 注册: 2009-03-04
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-06-07 22:03:57
wwdxx2004(金币+2):谢谢 2010-06-08 20:05:34
wwdxx2004(金币+2): 2010-06-09 22:36:26
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-06-07 22:03:57
wwdxx2004(金币+2):谢谢 2010-06-08 20:05:34
wwdxx2004(金币+2): 2010-06-09 22:36:26
|
1.你的片段序列是否正确，如果还不确定先连到PUC57里面去测个序，正确后再连接目标载体。 2.连接时片段和载体的比例控制在3:1到5:1之间，载体去磷酸化可提高阳性率。 3.如果怀疑感受态细胞的效价建议买商品化的感受态细胞，不算贵，一管大概10块钱左右吧。 4.适当延长连接时间，很多实验室连接过夜后再转化。 另外T4DNA连接酶是热敏感性很强的酶，如果温度超过25度酶活性会急剧降低。祝你成功 |
8楼2010-06-07 21:20:41
9楼2010-06-07 23:30:45
空谷幽风
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 32
- 应助: 13 (小学生)
- 贵宾: 0.05
- 金币: 1106.1
- 散金: 500
- 红花: 13
- 帖子: 615
- 在线: 116.5小时
- 虫号: 714271
- 注册: 2009-03-04
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
10楼2010-06-15 22:27:13