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nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)

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[求助] 为什么最近做连接转化总是失败

本人最近用TaKaRa的pMD18-T Vector做连接转化，感受态用过自己做的和别人做的都不长菌落，也用过买的感受态，只长了不到10个菌落挑单克隆后做菌液PCR检测发现都是空载，请问是什么原因？请各位高手指教一下！！谢啦！（我的回收产物大小在600~700bp之间，回收产物4ul，载体1ul，SolutionI 5ul，16°C连接1h）

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1楼2012-02-24 13:36:21

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wuxmxjtu

禁虫 (初入文坛)

wanhscn(金币+2): 有道理！ 2012-02-25 15:53:05
西瓜: 回帖置顶 2012-02-25 19:20:18

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4楼2012-02-24 20:22:24

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zoeye

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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小丹木木(金币+3, MolEPI+1): 很有用哦 2012-02-27 10:50:18

1、可以先用感受态转质粒看看检查下是不是感受态的问题
2、新倒一批板排除板的问题
3、连接比例如果我没记错的话应该是
（载体用量如：100ng）/载体碱基数：T载大小）/（片段用量/片段碱基数600bp)=1:3 这个公式算一下（应该是的建议你查一下我经常会把两个比例记反）
4、你应该是用Taq酶P的吧不是的话记得要加A~~~
5、连接时间我一般都是4°过夜的如果楼主不急就延长一下连接时间吧
6、多转一点吧虽然我也是转的10微升你就转20好了
TaKaRa的pMD18-T Vector我一直在用觉得很好用很好构的
建议楼主在连接的时候可以把载体片段的量多做几管不同比例然后分别转化看看会不会好一点
希望对你有帮助