应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么最近做连接转化总是失败
211/3返回列表123下一页
查看: 4248  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)

[求助] 为什么最近做连接转化总是失败

本人最近用TaKaRa的pMD18-T Vector做连接转化，感受态用过自己做的和别人做的都不长菌落，也用过买的感受态，只长了不到10个菌落挑单克隆后做菌液PCR检测发现都是空载，请问是什么原因？请各位高手指教一下！！谢啦！（我的回收产物大小在600~700bp之间，回收产物4ul，载体1ul，SolutionI 5ul，16°C连接1h）
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-02-24 13:36:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

wuxmxjtu

禁虫 (初入文坛)
wanhscn(金币+2): 有道理！ 2012-02-25 15:53:05
西瓜: 回帖置顶 2012-02-25 19:20:18
本帖内容被屏蔽
4楼2012-02-24 20:22:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zoeye

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3, MolEPI+1): 很有用哦 2012-02-27 10:50:18
1、可以先用感受态转质粒看看 检查下是不是感受态的问题
2、新倒一批板 排除板的问题
3、连接比例 如果我没记错的话 应该是
（载体用量 如：100ng）/载体碱基数：T载大小）/（片段用量/片段碱基数600bp)=1:3 这个公式算一下（应该是的 建议你查一下 我经常会把两个比例记反）
4、你应该是用Taq酶P的吧 不是的话记得要加A~~~
5、连接时间 我一般都是4°过夜的 如果楼主不急 就延长一下连接时间吧
6、多转一点吧 虽然我也是转的10微升 你就转20好了
TaKaRa的pMD18-T Vector我一直在用 觉得很好用 很好构的
建议楼主在连接的时候可以把载体片段的量多做几管 不同比例 然后分别转化 看看会不会好一点
希望对你有帮助
赞一下(2人) 回复此楼
12楼2012-02-26 01:05:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

angie8610

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是氨苄过量了。。。。。。
赞一下 回复此楼
新手上路，多多关照！
2楼2012-02-24 14:58:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by angie8610 at 2012-02-24 14:58:03:
会不会是氨苄过量了。。。。。。

100ml的LB固体培养基我加了110ul的氨苄，不会太多吧
赞一下 回复此楼
3楼2012-02-24 18:53:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eagle00768

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用invitrogen 的pENTR载体试试，那个转化效率挺高的
赞一下 回复此楼
5楼2012-02-25 13:07:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
对的，同意三楼的，做个对照试验，我也有过这样的情况，可能是没有连接上
赞一下 回复此楼
6楼2012-02-25 13:55:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by wuxmxjtu at 2012-02-24 20:22:24:
建议转化的时候，做一个对照试验。用没有连接外来片段的质粒转化细菌作为对照，一对照就知道问题大概在哪儿了

做过对照实验，用以前提的质粒转过，是成功的，难道就是连接有问题吗？以前也是这样连接的几乎都成功啊
赞一下 回复此楼
7楼2012-02-25 16:17:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by eagle00768 at 2012-02-25 13:07:11:
用invitrogen 的pENTR载体试试，那个转化效率挺高的

TaKaRa的pMD18-T Vector转化效率应该也可以啊，以前一直用这个的，没有出现这种情况，是不是回收的片段有问题啊会影响连接？
赞一下 回复此楼
8楼2012-02-25 16:43:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eagle00768

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by nan_nan_2012 at 2012-02-25 16:43:44:
TaKaRa的pMD18-T Vector转化效率应该也可以啊，以前一直用这个的，没有出现这种情况，是不是回收的片段有问题啊会影响连接？

同意楼上几位所说的，转个空载体做个对照，同时转，看是不是真的连上了。如果没连上的话，建议换个载体吧。不过用pENTR的话正向引物前面要再加CACC，PCR产物是平末端的
赞一下 回复此楼
9楼2012-02-25 16:55:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eagle00768

木虫 (小有名气)
wanhscn(金币+5): 应助很踊跃，5金币奖励 2012-02-25 17:18:50
西瓜(金币+2): 鼓励热心应助 2012-02-25 19:22:50
引用回帖:
8楼: Originally posted by nan_nan_2012 at 2012-02-25 16:43:44:
TaKaRa的pMD18-T Vector转化效率应该也可以啊，以前一直用这个的，没有出现这种情况，是不是回收的片段有问题啊会影响连接？

回收的片段不大阿，应该不会有什么问题
赞一下 回复此楼
10楼2012-02-25 16:57:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 nan_nan_2012 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 366求调剂 +4 不知名的小卅 2026-04-11 4/200 2026-04-11 15:10 by 凯凯要变帅
[考研] 295求调剂 +4 A你好研究生 2026-04-04 4/200 2026-04-11 14:19 by 木鱼.
[考研] 262求调剂 +12 天下第一文 2026-04-04 15/750 2026-04-11 14:09 by 释放天性
[考研] 305求调剂 +5 77Qi 2026-04-07 5/250 2026-04-11 11:45 by zhq0425
[考研] 288求调剂 +15 代fish 2026-04-09 16/800 2026-04-11 10:26 by wwj2530616
[考研] 工科273调剂 +6 X1999 2026-04-09 7/350 2026-04-11 10:23 by zhq0425
[考研] 0831生医工第一轮调剂失败求助 +10 小熊睿睿_s 2026-04-11 13/650 2026-04-11 10:04 by maddjdld
[考研] 080500求调剂 +17 黄宇博 2026-04-06 17/850 2026-04-11 08:36 by zhq0425
[考研] 生物学308求调剂（一志愿华东师大） +6 相信必会光芒万� 2026-04-10 6/300 2026-04-11 05:23 by zhuwenxu
[考研] 计算机类求调剂，22408-274分 +7 上岸de小虫 2026-04-09 8/400 2026-04-10 19:56 by fxue1114
[考研] 0858求调剂 5+5 Gky09300550， 2026-04-10 8/400 2026-04-10 19:13 by chemisry
[考研] 266求调剂 +29 阳阳哇塞 2026-04-07 29/1450 2026-04-10 16:20 by 高维春
[考研] 269求调剂 +10 啊啊我我 2026-04-07 10/500 2026-04-10 10:38 by 高维春
[考研] 生物与医药调剂 +5 十七sa 2026-04-05 5/250 2026-04-10 08:14 by kangsm
[考研] 085404，285分求调剂 +12 薇薇考研 2026-04-07 14/700 2026-04-09 23:10 by parmtree
[考研] 367求调剂 +10 hffQAQ 2026-04-09 10/500 2026-04-09 18:06 by lijunpoly
[考研] 一志愿西南大学生物学学硕344 求生物学相关调剂/生物与医药 +7 超人不会飞@ 2026-04-08 7/350 2026-04-09 09:35 by gong120082
[考研] 材料考研求调剂总分280 +30 mkjlz1 2026-04-06 35/1750 2026-04-08 21:25 by cyh—315
[考研] 263分B区求调剂 +6 李nihao 2026-04-08 6/300 2026-04-08 09:38 by 南开小綦
[考研] 求调剂到0856材料工程 +3 程9915 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:15 by 蓝云思雨
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭