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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么最近做连接转化总是失败
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接时间太短了吧，我们一般连接过夜的。还有可能是你用的感受态不行哦。你可以做个对照，找出原因。
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11楼2012-02-25 18:07:32
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zoeye

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3, MolEPI+1): 很有用哦 2012-02-27 10:50:18
1、可以先用感受态转质粒看看 检查下是不是感受态的问题
2、新倒一批板 排除板的问题
3、连接比例 如果我没记错的话 应该是
（载体用量 如：100ng）/载体碱基数：T载大小）/（片段用量/片段碱基数600bp)=1:3 这个公式算一下（应该是的 建议你查一下 我经常会把两个比例记反）
4、你应该是用Taq酶P的吧 不是的话记得要加A~~~
5、连接时间 我一般都是4°过夜的 如果楼主不急 就延长一下连接时间吧
6、多转一点吧 虽然我也是转的10微升 你就转20好了
TaKaRa的pMD18-T Vector我一直在用 觉得很好用 很好构的
建议楼主在连接的时候可以把载体片段的量多做几管 不同比例 然后分别转化 看看会不会好一点
希望对你有帮助
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12楼2012-02-26 01:05:39
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li-spring

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也连续做了六次 感觉都没有连接上，转化细菌长的很慢 48小时才长出来
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13楼2012-02-26 10:06:41
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zhongmianhua

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-27 10:50:45
这个原因我还真晓得，我遇见过，本人觉得首先是你回收的片段太小，还有再加上另外一种可能回收条带亮度不太行，接着用快连时间太短，导致效率不是很好，建议，回收片段亮度要提高，其次可以用慢连，放在室温16度，过夜，然后明天会出现很多单菌落（前提是体系要对）。
要多给点金币啊
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体会生活
14楼2012-02-27 00:16:40
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nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by dappxiaomm at 2012-02-25 18:07:32:
连接时间太短了吧，我们一般连接过夜的。还有可能是你用的感受态不行哦。你可以做个对照，找出原因。

我们实验室一直都是16°C连1h的，几乎都没问题，时间太长会不会导致很多自连啊？
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15楼2012-02-27 10:54:31
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nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by zoeye at 2012-02-26 01:05:39:
1、可以先用感受态转质粒看看 检查下是不是感受态的问题
2、新倒一批板 排除板的问题
3、连接比例 如果我没记错的话 应该是
（载体用量 如：100ng）/载体碱基数：T载大小）/（片段用量/片段碱基数600bp)=1:3  ...

谢谢你的建议，我试试吧
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16楼2012-02-27 10:56:00
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nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by zhongmianhua at 2012-02-27 00:16:40:
这个原因我还真晓得，我遇见过，本人觉得首先是你回收的片段太小，还有再加上另外一种可能回收条带亮度不太行，接着用快连时间太短，导致效率不是很好，建议，回收片段亮度要提高，其次可以用慢连，放在室温16度， ...

我以前回收过250bp的片段，然后连接转化也做出来了。那怎样提高回收片段的亮度？我的金币不多了呀，呵呵~~
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17楼2012-02-27 10:59:00
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nan_nan_2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by li-spring at 2012-02-26 10:06:41:
我也连续做了六次 感觉都没有连接上，转化细菌长的很慢 48小时才长出来

好痛苦啊，做分子的孩纸伤不起呀~~
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18楼2012-02-27 11:00:51
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-27 13:36:55
一、16度过夜大概十来个小时，一个小时效果很差 的。
二、感受态细胞最好买公司分装好的。
三、10微升体系已经足够了。
四、切胶回收的时候，测一下浓度，一般70~100ng/微升,浓度太低，也不行。也可以跑一块琼脂糖看看回收效果。
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总有一天我要修改用户名。
19楼2012-02-27 11:42:22
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艰苦温度

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zoeye at 2012-02-26 01:05:39
1、可以先用感受态转质粒看看 检查下是不是感受态的问题
2、新倒一批板 排除板的问题
3、连接比例 如果我没记错的话 应该是
（载体用量 如：100ng）/载体碱基数：T载大小）/（片段用量/片段碱基数600bp)=1:3 这 ...

请问加A是什么意思啊？
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20楼2014-01-09 13:24:47
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