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为什么最近做连接转化总是失败
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| 本人最近用TaKaRa的pMD18-T Vector做连接转化，感受态用过自己做的和别人做的都不长菌落，也用过买的感受态，只长了不到10个菌落挑单克隆后做菌液PCR检测发现都是空载，请问是什么原因？请各位高手指教一下！！谢啦！（我的回收产物大小在600~700bp之间，回收产物4ul，载体1ul，SolutionI 5ul，16°C连接1h） |
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【答案】应助回帖
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小丹木木(金币+3, MolEPI+1): 很有用哦 2012-02-27 10:50:18
小丹木木(金币+3, MolEPI+1): 很有用哦 2012-02-27 10:50:18
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1、可以先用感受态转质粒看看 检查下是不是感受态的问题 2、新倒一批板 排除板的问题 3、连接比例 如果我没记错的话 应该是 （载体用量 如：100ng）/载体碱基数：T载大小）/（片段用量/片段碱基数600bp)=1:3 这个公式算一下（应该是的 建议你查一下 我经常会把两个比例记反） 4、你应该是用Taq酶P的吧 不是的话记得要加A~~~ 5、连接时间 我一般都是4°过夜的 如果楼主不急 就延长一下连接时间吧 6、多转一点吧 虽然我也是转的10微升 你就转20好了 TaKaRa的pMD18-T Vector我一直在用 觉得很好用 很好构的 建议楼主在连接的时候可以把载体片段的量多做几管 不同比例 然后分别转化 看看会不会好一点 希望对你有帮助 |
12楼2012-02-26 01:05:39