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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
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nestzhao

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～

一直在做质粒构建的工作，时间已经花了好几个月了，但是一直没有结果。各种反应条件，连接体系等都试过，都没什么用。我实在是找不出什么原因了？或者本来我这个载体的选择或者酶切位点的选择就不太对？希望高手能够指点一下！！多谢了！！

我这个质粒构建的相关信息如下：
载体：pET28b(+)
片段长度：1.6kb左右
酶切位点：Nco I  CATGCCATGG  （下划线为酶切位点，前面的为保护碱基）
                 CGGGATCC
连接用T4DNA连接酶连接
16度水浴过夜

尝试过多次，连接后大多数时间没有出现出现阳性转化子，偶尔有阳性转化子，但是是假阳性的。
同时构建的另一个基因已经构建好了，用的载体和感受态细胞都是一样，所以这两个应该没什么问题。

我实在找不出问题出在哪了，希望高手指点！！！
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1楼 2011-03-09 22:50:03
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

龙开聪

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
436635楼: Originally posted by nestzhao at 2011-03-10 12:13:11:
恩  先去试试看  希望能有好结果

楼主葡萄糖加了没有，是不是葡萄糖和氨苄一起加到LB琼脂平板里面，做出来效果如何，我现在遇到同样问题
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16楼2012-04-10 09:27:17
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普通回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:47:10
lstt09nk(金币+1): 感谢交流 2011-03-10 13:05:19
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-09 22:50:03:
一直在做质粒构建的工作，时间已经花了好几个月了，但是一直没有结果。各种反应条件，连接体系等都试过，都没什么用。我实在是找不出什么原因了？或者本来我这个载体的选择或者酶切位点的选择就不太对？希望高手能 ...

可能是微量的表达对宿主有影响。可以尝试用培养基里面加葡萄糖。
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2楼2011-03-09 23:31:56
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zhengfan1109

银虫 (正式写手)
★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:47:05
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流，欢迎常来 2011-03-10 13:05:49
排除感受态和载体问题，我想连接酶，试剂的问题也排除了。
考虑一种可能性：
不知道LZ知道你要连接的这段DNA的序列吗？
是否有可能序列中包含两个酶切位点的序列，考虑更改内切酶。
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3楼2011-03-10 01:13:50
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magy2006

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:49:04
片段长，难连接，正常现象，连接时间加长，使用好一些的感受态或许有好的结果……
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4楼2011-03-10 08:19:47
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-09 23:31:56:
可能是微量的表达对宿主有影响。可以尝试用培养基里面加葡萄糖。

培养基里面加葡萄糖？加在倒平板的固体培养基中？？还是所有的培养基都加？？
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5楼2011-03-10 08:46:53
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by magy2006 at 2011-03-10 08:19:47:
片段长，难连接，正常现象，连接时间加长，使用好一些的感受态或许有好的结果……

这个可以试试，但不知道多少时间比较适合，有没有推荐一下的？
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6楼2011-03-10 08:50:18
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhengfan1109 at 2011-03-10 01:13:50:
排除感受态和载体问题，我想连接酶，试剂的问题也排除了。
考虑一种可能性：
不知道LZ知道你要连接的这段DNA的序列吗？
是否有可能序列中包含两个酶切位点的序列，考虑更改内切酶。

这个我觉得应该没有的吧，因为当初选择酶切位点的时候，也是用软件r查找过的
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7楼2011-03-10 08:52:09
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 12:13:40
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-03-10 13:06:39
竟然另一个连接成功了，说明试剂和操作没多大问题。
不知道你是否是PCR后，片段直接酶切，与载体酶切连接，如果是这样的话
个人认为问题出在第二酶切位点的保护碱基太少了，一般至少是2个。
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8楼2011-03-10 08:55:14
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 12:12:45
lstt09nk(金币+1): 希望对楼主有所帮助 2011-03-10 13:07:20
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-10 08:46:53:
培养基里面加葡萄糖？加在倒平板的固体培养基中？？还是所有的培养基都加？？

恩，在LB里面加。转化出来涂板用的培养基中加入1%葡萄糖。
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9楼2011-03-10 09:23:48
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-10 09:23:48:
恩，在LB里面加。转化出来涂板用的培养基中加入1%葡萄糖。

恩  先去试试看  希望能有好结果
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10楼2011-03-10 12:13:11
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-10 08:55:14:
竟然另一个连接成功了，说明试剂和操作没多大问题。
不知道你是否是PCR后，片段直接酶切，与载体酶切连接，如果是这样的话
个人认为问题出在第二酶切位点的保护碱基太少了，一般至少是2个。

我是在PCR后，将PCR产物纯化后，进行酶切，然后再与载体连接。。。

也尝试过酶切TA克隆的重组质粒，然后回收目标片段，再与载体连接，同样没有结果
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11楼2011-03-10 12:15:54
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101202139

铜虫 (小有名气)
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 22:42:28
我个人认为可能是酶连体系的问题，一般情况下，10ul的体系中我会加0.5ul的载体片段，8ul的目的片段，或者也可以利用1pml，1000bp的DNA的重量是0.66ug的公式算出体积。另外酶连时间也应该延长一些，我一般连24小时！但愿对你有帮助
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12楼2011-03-10 20:16:49
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nestzhao

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 101202139 at 2011-03-10 20:16:49:
我个人认为可能是酶连体系的问题，一般情况下，10ul的体系中我会加0.5ul的载体片段，8ul的目的片段，或者也可以利用1pml，1000bp的DNA的重量是0.66ug的公式算出体积。另外酶连时间也应该延长一些，我一般连24小时 ...

我以前一般是只连接过夜的，最近的实验计划是想把连接时间延长，具体就是不知道多少时间比较适合。。。
你这个0.5ul的载体片段，8ul的目的片段，他们两者的实际比例大概是多少啊？？

另外，还想问一下，你这个连接的时候，用的水浴是普通的静态水浴还是带扰动的水浴啊？这两者有没有区别啊？？或者说哪个好啊？？

先谢谢了
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13楼2011-03-10 22:46:45
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101202139

铜虫 (小有名气)
nestzhao(金币+1): 2011-03-11 12:03:16
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-10 22:46:45:
我以前一般是只连接过夜的，最近的实验计划是想把连接时间延长，具体就是不知道多少时间比较适合。。。
你这个0.5ul的载体片段，8ul的目的片段，他们两者的实际比例大概是多少啊？？

另外，还想问一下，你这 ...

0.5ul的载体片段，8ul的目的片段应该是我们实验室的经验值，如果还做不出来的话就是当提高一下载体片段的体积。我们将连接液放在16度里的冰箱里，并浸泡在盛水的小烧杯中，不放在水浴锅中。
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14楼2011-03-11 10:55:49
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wgx1128

金虫 (正式写手)
nestzhao(金币+1): 2011-03-11 12:04:03
把载体酶切后去磷酸化处理再和目的片段连接
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15楼2011-03-11 11:34:53
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主问题最后怎么解决的？
我最近碰到的问题与你类似
但每次都有斑，有时候长的还似乎蛮好

但是质粒酶切检测每次都是假阳性，
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17楼2013-10-24 23:22:40
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