应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
51/1返回列表
查看: 2917  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

nestzhao

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～

一直在做质粒构建的工作，时间已经花了好几个月了，但是一直没有结果。各种反应条件，连接体系等都试过，都没什么用。我实在是找不出什么原因了？或者本来我这个载体的选择或者酶切位点的选择就不太对？希望高手能够指点一下！！多谢了！！

我这个质粒构建的相关信息如下：
载体：pET28b(+)
片段长度：1.6kb左右
酶切位点：Nco I  CATGCCATGG  （下划线为酶切位点，前面的为保护碱基）
                 CGGGATCC
连接用T4DNA连接酶连接
16度水浴过夜

尝试过多次，连接后大多数时间没有出现出现阳性转化子，偶尔有阳性转化子，但是是假阳性的。
同时构建的另一个基因已经构建好了，用的载体和感受态细胞都是一样，所以这两个应该没什么问题。

我实在找不出问题出在哪了，希望高手指点！！！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

实验操作

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-03-09 22:50:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)
★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 12:13:40
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-03-10 13:06:39
竟然另一个连接成功了，说明试剂和操作没多大问题。
不知道你是否是PCR后，片段直接酶切，与载体酶切连接，如果是这样的话
个人认为问题出在第二酶切位点的保护碱基太少了，一般至少是2个。
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2011-03-10 08:55:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:47:10
lstt09nk(金币+1): 感谢交流 2011-03-10 13:05:19
引用回帖:
Originally posted by nestzhao at 2011-03-09 22:50:03:
一直在做质粒构建的工作，时间已经花了好几个月了，但是一直没有结果。各种反应条件，连接体系等都试过，都没什么用。我实在是找不出什么原因了？或者本来我这个载体的选择或者酶切位点的选择就不太对？希望高手能 ...

可能是微量的表达对宿主有影响。可以尝试用培养基里面加葡萄糖。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-03-09 23:31:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhengfan1109

银虫 (正式写手)
★
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:47:05
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流，欢迎常来 2011-03-10 13:05:49
排除感受态和载体问题，我想连接酶，试剂的问题也排除了。
考虑一种可能性：
不知道LZ知道你要连接的这段DNA的序列吗？
是否有可能序列中包含两个酶切位点的序列，考虑更改内切酶。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-03-10 01:13:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

magy2006

木虫 (著名写手)
nestzhao(金币+1): 2011-03-10 08:49:04
片段长，难连接，正常现象，连接时间加长，使用好一些的感受态或许有好的结果……
赞一下 回复此楼
4楼2011-03-10 08:19:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭