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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
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nestzhao

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～

一直在做质粒构建的工作，时间已经花了好几个月了，但是一直没有结果。各种反应条件，连接体系等都试过，都没什么用。我实在是找不出什么原因了？或者本来我这个载体的选择或者酶切位点的选择就不太对？希望高手能够指点一下！！多谢了！！

我这个质粒构建的相关信息如下：
载体：pET28b(+)
片段长度：1.6kb左右
酶切位点：Nco I  CATGCCATGG  （下划线为酶切位点，前面的为保护碱基）
                 CGGGATCC
连接用T4DNA连接酶连接
16度水浴过夜

尝试过多次，连接后大多数时间没有出现出现阳性转化子，偶尔有阳性转化子，但是是假阳性的。
同时构建的另一个基因已经构建好了，用的载体和感受态细胞都是一样，所以这两个应该没什么问题。

我实在找不出问题出在哪了，希望高手指点！！！
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1楼 2011-03-09 22:50:03
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wgx1128

金虫 (正式写手)
nestzhao(金币+1): 2011-03-11 12:04:03
把载体酶切后去磷酸化处理再和目的片段连接
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15楼2011-03-11 11:34:53
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