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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。
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天使托

专家顾问 (职业作家)

[交流] 请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。

昨日看见某帖子说关于验证重组载体，楼下有位朋友说用快检的方法可以迅速检测出来。。。

这是该朋友的回帖的原内容：
快检就是直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心，
取上清跑胶，对照上个空载体，就是没有连片段前的质粒（环合的哈），
或者和你载体差不多大小的质粒也可，一般连进去的重组质粒会跑得慢点，
凭这个就能鉴定哪些连进去了，然后再提质粒酶切就好了

因为我们实验室就是一般的PCR，酶切质粒来验证，快检没有做过，所以我想问问大家具体的方法是什么？原理又是怎样？谢谢了！
苯酚和氯仿的作用是什么呢？

谢谢了。。。。。
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1楼 2011-04-29 10:45:38
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

郝钊

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5): 欢迎交流 2011-04-30 09:16:49
天使托(金币+1): 2011-05-13 12:30:31
我们实验室也在用这个方法，PCR验证假阳性率比较高，如果挑的转化子比较多，提质粒不仅费时费力，还浪费试剂盒。实验室一个师兄按照分子生物学手册上的配方配了一个快速裂解液，好像有甘油，溴酚蓝，SDS之类的。转化子长好后，取1ml菌液，离心弃上清，加入50μl上述裂解液，重悬后37℃保温半小时，之后离心，上清直接上样就可以了，一定记得加marker和空载体。在电泳图上你可以同时看到RNA（如果没加RNAase的话），质粒，基因组。这个方法快速，简单，便宜，大家可以尝试一下。
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10楼2011-04-30 08:57:13
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郝钊

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+5, EPI+1): 感谢分享！我们实验室没有用特殊的缓冲液，就苯酚氯仿，用得一直也不错呢。 2011-05-16 16:43:37
引用回帖:
Originally posted by proteinwang at 2011-05-04 14:37:39:
您好！您介绍的方法比较靠谱，能不能把快速裂解液的配方给大家共享一下？
谢谢了，估计很多人在期待呢！

不好意思，我今天才看到你的回复。快速裂解液的配方：
50mmol/L  Tris-HCl  （pH6.8）
1%   SDS  
2mmol/L   EDTA
400mmol/L  蔗糖
0.01%   溴酚蓝   
如果在使用过程中发现细胞裂解太严重，就是离心取上清时发现蛋白沉淀黏黏糊糊那就把SDS的量降低点。你可以先把其他的药品配好，取出一部分来加入不同的SDS试一试，我配过两次有一次比较好用，另外一次就发现SDS可能太多了，可能不同公司的SDS质量也不太一样造成的吧。
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12楼2011-05-16 10:38:16
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
★
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天使托(金币+1): 原理是什么呢？ 2011-04-29 11:24:39
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-29 10:45:38:
昨日看见某帖子说关于验证重组载体，楼下有位朋友说用快检的方法可以迅速检测出来。。。

这是该朋友的回帖的原内容：
快检就是直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心，
取上清跑胶，对 ...

直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心

这一步就是粗提质粒吧，然后跑胶对比质粒大小？
我是这么理解的

不过我们实验室一般是要酶切验证的，这个对构建前后质粒差别较大的才有用
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3楼2011-04-29 11:08:43
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小小_木虫

木虫 (小有名气)
★
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以前听一个师兄好像说过快速提质粒的方法，和这个快检差不多，但是没有细问，期待大家的答案。
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4楼2011-04-29 11:09:35
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david_xmu

金虫 (小有名气)
同样期待中
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5楼2011-04-29 11:18:06
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
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引用回帖:
Originally posted by xuguanghai at 2011-04-29 11:08:43:
直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心

这一步就是粗提质粒吧，然后跑胶对比质粒大小？
我是这么理解的

不过我们实验室一般是要酶切验证的，这个对构建前后质粒差别较大的才有用

这是一个不严谨的判断吧，就是比较质粒大小
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6楼2011-04-29 11:37:02
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
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天使托(金币+3): 谢谢了。。。。很好很强大！ 2011-04-29 12:25:46
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-04-30 09:16:11
快检就是直接比较质粒大小
用酚氯仿破菌后，离心后DNA和RNA都在上层水相里，
跑胶一般情况下能看见五条带，最上面是大肠杆菌的总DNA，第二条就是你的超螺旋的质粒，下面三条小的就是RNA，连进去的重组质粒和你的空载体大小有差别，大的跑胶跑得慢，空载体跑得快，电泳一看就一目了然了
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7楼2011-04-29 11:53:18
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
天使托(金币+1): 辛苦辛苦。。。 2011-04-29 12:25:57
苯酚氯仿的作用是破菌加蛋白变性
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8楼2011-04-29 11:54:29
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)
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dhd997(金币+6): 有道理 2011-04-30 09:16:32
天使托(金币+1): THX 不是外国的朋友就是夜猫子型的。 2011-04-30 11:48:22
个人感觉这只是初步判断而已，
提取之后看看有没有带被提升了，如果有的话，可以初步判断哪些转化成功了
那也是相对于插入片段大的，如果是100-200bp的，估计不明显（没验证，偶插入的是1.4kb的）
但具体还是要酶切和pcr 测序来看的
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9楼2011-04-30 04:56:01
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proteinwang

铜虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by 郝钊 at 2011-04-30 08:57:13:
我们实验室也在用这个方法，PCR验证假阳性率比较高，如果挑的转化子比较多，提质粒不仅费时费力，还浪费试剂盒。实验室一个师兄按照分子生物学手册上的配方配了一个快速裂解液，好像有甘油，溴酚蓝，SDS之类的。转 ...

您好！您介绍的方法比较靠谱，能不能把快速裂解液的配方给大家共享一下？
谢谢了，估计很多人在期待呢！
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11楼2011-05-04 14:37:39
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lww49731002

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
问题是，如果是载体自连跑出来的条带也会比空质粒滞后，那要怎么判断？？
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13楼2011-05-16 11:24:39
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meizishu

禁虫 (小有名气)
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本帖内容被屏蔽
14楼2011-05-16 15:06:07
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ytb1530

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
今天按着配方配了 试试希望效果不错
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15楼2013-03-22 10:10:46
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
★
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都有人做过吗？效果怎样？靠得住吗？
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16楼2013-10-25 00:00:24
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zyxme2楼
2011-04-29 11:04   回复  
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