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天使托专家顾问 (职业作家)
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[交流]
请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。
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昨日看见某帖子说关于验证重组载体，楼下有位朋友说用快检的方法可以迅速检测出来。。。 这是该朋友的回帖的原内容： 快检就是直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心， 取上清跑胶，对照上个空载体，就是没有连片段前的质粒（环合的哈）， 或者和你载体差不多大小的质粒也可，一般连进去的重组质粒会跑得慢点， 凭这个就能鉴定哪些连进去了，然后再提质粒酶切就好了 因为我们实验室就是一般的PCR，酶切质粒来验证，快检没有做过，所以我想问问大家具体的方法是什么？原理又是怎样？谢谢了！ 苯酚和氯仿的作用是什么呢？ 谢谢了。。。。。 |
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 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 |
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+5): 欢迎交流 2011-04-30 09:16:49
天使托(金币+1): 2011-05-13 12:30:31
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+5): 欢迎交流 2011-04-30 09:16:49
天使托(金币+1): 2011-05-13 12:30:31
| 我们实验室也在用这个方法，PCR验证假阳性率比较高，如果挑的转化子比较多，提质粒不仅费时费力，还浪费试剂盒。实验室一个师兄按照分子生物学手册上的配方配了一个快速裂解液，好像有甘油，溴酚蓝，SDS之类的。转化子长好后，取1ml菌液，离心弃上清，加入50μl上述裂解液，重悬后37℃保温半小时，之后离心，上清直接上样就可以了，一定记得加marker和空载体。在电泳图上你可以同时看到RNA（如果没加RNAase的话），质粒，基因组。这个方法快速，简单，便宜，大家可以尝试一下。 |
10楼2011-04-30 08:57:13
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 感谢分享！我们实验室没有用特殊的缓冲液，就苯酚氯仿，用得一直也不错呢。 2011-05-16 16:43:37
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 感谢分享！我们实验室没有用特殊的缓冲液，就苯酚氯仿，用得一直也不错呢。 2011-05-16 16:43:37
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不好意思，我今天才看到你的回复。快速裂解液的配方： 50mmol/L Tris-HCl （pH6.8） 1% SDS 2mmol/L EDTA 400mmol/L 蔗糖 0.01% 溴酚蓝 如果在使用过程中发现细胞裂解太严重，就是离心取上清时发现蛋白沉淀黏黏糊糊那就把SDS的量降低点。你可以先把其他的药品配好，取出一部分来加入不同的SDS试一试，我配过两次有一次比较好用，另外一次就发现SDS可能太多了，可能不同公司的SDS质量也不太一样造成的吧。 |
12楼2011-05-16 10:38:16
3楼2011-04-29 11:08:43
4楼2011-04-29 11:09:35
5楼2011-04-29 11:18:06
6楼2011-04-29 11:37:02
7楼2011-04-29 11:53:18
8楼2011-04-29 11:54:29
xiaoweiwei121
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9楼2011-04-30 04:56:01
11楼2011-05-04 14:37:39
13楼2011-05-16 11:24:39
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14楼2011-05-16 15:06:07
15楼2013-03-22 10:10:46
16楼2013-10-25 00:00:24
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zyxme2楼
2011-04-29 11:04
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