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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。
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天使托

专家顾问 (职业作家)

[交流] 请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。

昨日看见某帖子说关于验证重组载体，楼下有位朋友说用快检的方法可以迅速检测出来。。。

这是该朋友的回帖的原内容：
快检就是直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心，
取上清跑胶，对照上个空载体，就是没有连片段前的质粒（环合的哈），
或者和你载体差不多大小的质粒也可，一般连进去的重组质粒会跑得慢点，
凭这个就能鉴定哪些连进去了，然后再提质粒酶切就好了

因为我们实验室就是一般的PCR，酶切质粒来验证，快检没有做过，所以我想问问大家具体的方法是什么？原理又是怎样？谢谢了！
苯酚和氯仿的作用是什么呢？

谢谢了。。。。。
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1楼 2011-04-29 10:45:38
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郝钊

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5): 欢迎交流 2011-04-30 09:16:49
天使托(金币+1): 2011-05-13 12:30:31
我们实验室也在用这个方法，PCR验证假阳性率比较高，如果挑的转化子比较多，提质粒不仅费时费力，还浪费试剂盒。实验室一个师兄按照分子生物学手册上的配方配了一个快速裂解液，好像有甘油，溴酚蓝，SDS之类的。转化子长好后，取1ml菌液，离心弃上清，加入50μl上述裂解液，重悬后37℃保温半小时，之后离心，上清直接上样就可以了，一定记得加marker和空载体。在电泳图上你可以同时看到RNA（如果没加RNAase的话），质粒，基因组。这个方法快速，简单，便宜，大家可以尝试一下。
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10楼2011-04-30 08:57:13
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
★
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天使托(金币+1): 原理是什么呢？ 2011-04-29 11:24:39
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-29 10:45:38:
昨日看见某帖子说关于验证重组载体，楼下有位朋友说用快检的方法可以迅速检测出来。。。

这是该朋友的回帖的原内容：
快检就是直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心，
取上清跑胶，对 ...

直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心

这一步就是粗提质粒吧，然后跑胶对比质粒大小？
我是这么理解的

不过我们实验室一般是要酶切验证的，这个对构建前后质粒差别较大的才有用
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3楼2011-04-29 11:08:43
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小小_木虫

木虫 (小有名气)
★
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以前听一个师兄好像说过快速提质粒的方法，和这个快检差不多，但是没有细问，期待大家的答案。
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4楼2011-04-29 11:09:35
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
Originally posted by xuguanghai at 2011-04-29 11:08:43:
直接用摇起的菌液取100uL，加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心

这一步就是粗提质粒吧，然后跑胶对比质粒大小？
我是这么理解的

不过我们实验室一般是要酶切验证的，这个对构建前后质粒差别较大的才有用

这是一个不严谨的判断吧，就是比较质粒大小
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6楼2011-04-29 11:37:02
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