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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组质粒双酶切问题
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goumiaoge

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒双酶切问题

各位大侠，客套话就不多说了，请包涵。我在做原核表达，重组质粒转化到BL21后，做菌液PCR无目的条带，提质粒后做质粒PCR有目的条带，但是双酶切却切不出条带来，何解？
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1楼 2011-07-31 10:15:23
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futuregarden

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎新虫交流 2011-08-01 16:56:35
个人理解
1.用PCR引物测序看一下是否是目的基因。
若是，看酶切位点是否正确，
若有酶切位点，那就是酶切体系的原因了
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2楼2011-07-31 10:39:47
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goumiaoge

新虫 (初入文坛)
酶切体系的影响真会这么大吗？我更改过几次体系，都不行，会不会有其他什么原因。我是测序正确后才转化的。酶切位点没有问题。我如果继续切不出来的话，还能做后面的诱导表达吗？
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3楼2011-08-01 09:40:19
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cyzhgt

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！确实如此，应该先转化到克隆菌株，验证质粒正确后再转化到表达菌株。 2011-08-01 16:58:03
1、每个酶都做一个单酶切，确定内切酶没有问题
2、BL21(DE3)是表达菌株，我觉得应该先把重组质粒转到克隆菌株如DH5a、Top10上，然后再提质粒再做双酶切，因为不同菌株的基因型不一样，对质粒的修饰可能也不一样，有一些酶对甲基化的位点是没有作用的。
暂时就想到这么多。。。
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4楼2011-08-01 09:57:44
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-08-01 16:58:35
1、你提取的质粒浓度怎么样？？
2、你的双酶切体系是？？酶是否失活
建议20微升的体系，质粒2-5微升，同时做单酶切和双酶切验证
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5楼2011-08-01 09:57:57
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goumiaoge

新虫 (初入文坛)
我做了单酶切，双酶切体系也更改了几次，20微升体系，质粒用过10，14.质粒浓度还比较高吧，5微升marker，比marker亮许多。感谢！
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6楼2011-08-01 15:09:09
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