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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒是否需要酶切后再电泳？
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friya0910

新虫 (正式写手)

[交流] 质粒是否需要酶切后再电泳？ 已有5人参与

将连接有目的片段的质粒做双酶切，跑电泳的时候想加一个空质粒，那这个空质粒是不是应该先单酶切一下啊？不然跑出来的不是线性的话就和前面双酶切的就没有可比性了啊？
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1楼 2011-07-04 21:15:20
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toxicpeach

木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-07-05 00:37:34
空载体也双酶切了，这样才是最恰当的对照
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海纳百川有容乃大，壁立千尺无欲则刚
2楼2011-07-04 21:32:53
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by toxicpeach at 2011-07-04 21:32:53:
空载体也双酶切了，这样才是最恰当的对照

可是空载体上没有那两个酶切位点啊！
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3楼2011-07-04 21:43:44
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+4): Good！ 2011-07-05 00:40:09
你的对照做的有问题，你是双酶切重组载体，所以对照应该是双酶切的空载体和双酶切的基因，加上你酶切的重组载体，如果切下的两个片段和对照一样大，那么就没问题啦。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-07-04 23:05:53
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-07-04 21:43:44:
可是空载体上没有那两个酶切位点啊！

空载体上没有你那两个酶切位点你当初怎么做的连接呢？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-07-04 23:07:02
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): good 2011-07-05 08:00:19
如果是同尾酶，那么用A和B切外源片段，用A和C切载体，连接之后克隆子的酶切位点变为A和D，B和C切口连接之后变为D的位点？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2011-07-05 01:05:10
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-07-04 23:07:02:
空载体上没有你那两个酶切位点你当初怎么做的连接呢？

我现在只是把目的片段连接到了pMD19-T载体上，还没做到双酶切重组质粒这一步，我现在就想把目的片段从pMD19-T载体上切下来，切完之后跑胶需不需要加一个空载体做对照啊？还是只要切的目的片段大小差不多就行啊？还有一个问题是我才发现pMD19-T载体在TA克隆位点后居然有我的下游引物的酶切位点BamHI 这样会不会影响酶切啊？最后双酶切以后会是3条带吗？
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7楼2011-07-05 12:56:48
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caosaihlwsh

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励交流。又快又准是要钱砸出来滴…… 2011-07-05 17:11:40
还不如直接送质粒去测序公司来得又快又准！
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8楼2011-07-05 15:43:21
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5, EPI+1): 辛苦，一并奖励了 2011-07-05 19:16:27
我现在只是把目的片段连接到了pMD19-T载体上，还没做到双酶切重组质粒这一步，我现在就想把目的片段从pMD19-T载体上切下来，切完之后跑胶需不需要加一个空载体做对照啊？

原来是TA克隆，目的是看有没有连接上外源片段。你没有必要双酶切那么费事的，单酶切就可以了。你这样做是需要加一个对照的，对照应该为空载体，选用的酶切位点最好是外源片段上没有的位点，同时在载体上只有一个位点，这样切出来无论是有没有带有外源片段，都是一条带，但是带有外源片段的质粒条带会大于不带外源片段的质粒。

如果是只在外源片段上有但是载体上没有的位点，那么如果酶失效了，或者其它原因导致酶切不成功，那么质粒就不被切开，判断起来就稍微麻烦了些。


还有一个问题是我才发现pMD19-T载体在TA克隆位点后居然有我的下游引物的酶切位点BamHI 这样会不会影响酶切啊？最后双酶切以后会是3条带吗？

不一定是三条带，如果两个位点之间相隔很近，那么切出来的条带会很短，跑胶的时候会跑出去根本看不见，毕竟在多克隆位点处的酶切位点是很密集的。你选用的鉴别方法可以再仔细考虑一下，包括单酶切还是双酶切，选用什么酶。
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9楼2011-07-05 18:48:56
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liling77ll

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-07-25 12:33:56
为验证双酶切是否成功,可做如下对照:
A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
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做最好的自己，和自己的昨天对比
10楼2011-07-25 10:13:08
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