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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒DNA可以不通过酶切直接跑电泳检测吗？
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wangy0908

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】质粒DNA可以不通过酶切直接跑电泳检测吗？

我最近做克隆，提取质粒DNA后，直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA，想看看是否是阳性的克隆，可是怎么也扩增不出来，所以第一个问题是请教各位：是否可以用这样的引物来扩增？我个人感觉理论上是可以的！
其次是，我的质粒DNA是不是有问题，也会导致这样的情况，那么就想请教质粒DNA是否不需要经过酶切而直接跑电泳检测呢？
以及如何来检测阳性克隆是做好的方法？谢谢大家

我筛选单菌落是用的IPTG和X-GOL，也就是挑选白色的单菌落后培养提取质粒DNA！
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1楼 2011-04-06 10:12:33
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whilecy

银虫 (初入文坛)
虽然不懂，但觉得你的研究很有前途，路过~
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2楼2011-04-06 10:24:21
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4): 鼓励 2011-04-06 14:06:25
wangy0908(金币+10): 2011-04-06 20:58:11
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆，提取质粒DNA后，直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA，想看看是否是阳性的克隆，可是怎么也扩增不出来，所以第一个问题是请教各位：是否可以用这样的引物来扩增？我个人感觉理论上是可以的！ ...

直接用是可以的，只要引物3‘和模板匹配较好就可以了，建议PCR时质粒模板先单酶切处理，这样PCR容易。质粒电泳如果看大小的话最好单酶切处理，不酶切的话电泳表现分子大小与实际大小有差别的。
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3楼2011-04-06 10:43:17
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
1949stone(EPI+1): 学习下 2011-04-06 14:07:00
wangy0908(金币+20): 2011-04-06 20:59:17
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆，提取质粒DNA后，直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA，想看看是否是阳性的克隆，可是怎么也扩增不出来，所以第一个问题是请教各位：是否可以用这样的引物来扩增？我个人感觉理论上是可以的！ ...

用你的引物来鉴定是没有问题的，确实单酶切之后效果会好，但得保证你的酶切位点不在PCR引物中。

个人认为你提取的质粒跑电泳是没有意义的。因为蓝白斑筛选也会有假阳性产生，特别是用pMD-18T载体，比20T的效果好差一些，当然价格上也便宜一些。lz的情况应该是假阳性克隆，最好不要单独根据颜色来筛选，可以采用菌落PCR先初步鉴定，然后摇菌提质粒，得到质粒后可以PCR，最好也单酶切后电泳来鉴定。不酶切直接跑电泳可能出现的情况比较复杂，不好判断。
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4楼2011-04-06 12:20:36
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zgle

金虫 (正式写手)
可以可以可以
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5楼2011-04-06 16:20:33
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wht_nmg

木虫 (著名写手)
认真看看
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6楼2011-04-06 16:42:22
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wht_nmg

木虫 (著名写手)
认真看看
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7楼2011-04-06 16:44:14
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-06 12:20:36:
用你的引物来鉴定是没有问题的，确实单酶切之后效果会好，但得保证你的酶切位点不在PCR引物中。

个人认为你提取的质粒跑电泳是没有意义的。因为蓝白斑筛选也会有假阳性产生，特别是用pMD-18T载体，比20T的效 ...

我没有进行酶切，就直接跑的PCR，怎么也扩增不出来。我用的是pGEM-T载体。
谢谢。还想问问，如果不酶切跑PCR，能跑出来的吗？因为如果能跑出来的话，我就觉得我的质粒DNA是肯定有问题了，就得重新再做链接以及转化这些的。
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9楼2011-04-07 07:18:00
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-04-06 10:43:17:
直接用是可以的，只要引物3‘和模板匹配较好就可以了，建议PCR时质粒模板先单酶切处理，这样PCR容易。质粒电泳如果看大小的话最好单酶切处理，不酶切的话电泳表现分子大小与实际大小有差别的。

谢谢。我跑的PCR的时候没有进行单酶切。如果不进行单酶切，能跑出来吗？
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10楼2011-04-07 07:23:20
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
wangy0908(金币+5): 谢谢，学习不少。呵呵 2011-04-07 10:40:01
dhd997(金币+3): 专业 2011-04-08 08:49:43
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-07 07:18:00:
我没有进行酶切，就直接跑的PCR，怎么也扩增不出来。我用的是pGEM-T载体。
谢谢。还想问问，如果不酶切跑PCR，能跑出来的吗？因为如果能跑出来的话，我就觉得我的质粒DNA是肯定有问题了，就得重新再做链接以及 ...

不酶切是可以直接作为模板进行PCR反应的。PCR过程需要加入阳性和阴性对照，如果你确定没有其他方面的问题，真的可能就是你的质粒有问题。

可以再做连接转化，重新筛选。

祝好运！
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12楼2011-04-07 09:12:12
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wangy0908

金虫 (正式写手)
希望能好运的啊，快做出来的，都做了很久了！
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13楼2011-04-07 10:41:20
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
wangy0908(金币+20): Thanks for your reply, I will try it! 2011-04-07 20:44:01
dhd997(金币+6, EPI+1): 欢迎继续交流 2011-04-08 08:50:05
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆，提取质粒DNA后，直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA，想看看是否是阳性的克隆，可是怎么也扩增不出来，所以第一个问题是请教各位：是否可以用这样的引物来扩增？我个人感觉理论上是可以的！ ...

1.其实最快速的方法是进行菌落PCR，可以省去提质粒这一步，节省时间，当然以质粒为模板来进行PCR验证也是完全没有任何问题的。
2.直接通过跑质粒来检测是否是阳性克隆是不保险的，因为质粒一般会跑出三条带，分别为超螺旋、开环和线性三种状态，如果你的插入片段不是特别大的话是无法区分的，还有一般从不同感受态细胞里提出的同一种质粒带型也是不同的，即使是同一种感受态细胞提出的同一种质粒有时带型也会有些许差异。
3.通过酶切验证是一种比较直观且相对可信的方法，因为有时候因为序列本身比较特殊（如高GC或二级结构比较多）或引物设计不够合理，通过普通PCR方法很难扩出来，用酶切验证就比较方便了。但前提是你要选好合适的酶切位点！单酶切或双酶切均可，不过你要知道切完后会出现几条带，每条带应该多大。
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14楼2011-04-07 12:48:23
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wangy0908

金虫 (正式写手)
今天我重新做了一次PCR，以前次PCR产物胶回收后作为模板，两次PCR的引物是一样的，但是今天得到的条带的大小明显比以前小了1kb左右，很是费解！这是什么原因造成的啊？因为我打算重新做链接和转化，所以就索性想这样来检查一下DNA，以找到什么地方有问题的！结果却出现了这样的现象！
为什么会出现这样的情况呢？
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15楼2011-04-08 05:08:35
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-08 05:08:35:
今天我重新做了一次PCR，以前次PCR产物胶回收后作为模板，两次PCR的引物是一样的，但是今天得到的条带的大小明显比以前小了1kb左右，很是费解！这是什么原因造成的啊？因为我打算重新做链接和转化，所以就索性想这 ...

先确认一下你的引物与模板的错配严不严重
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17楼2011-04-08 10:52:02
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p120933799

金虫 (小有名气)
可以
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18楼2011-04-08 11:57:19
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sfb1020

金虫 (小有名气)
没有单酶切也可以P出来，我一直就这么做。直接用提的质粒进行PCR，如果能P出来，再进行酶切。
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19楼2011-04-08 16:00:55
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wangy0908

金虫 (正式写手)
还有其他正解没有？谢谢大家
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20楼2011-04-10 22:28:18
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匿名

用户注销 (初入文坛)
本帖仅楼主可见
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21楼2011-04-11 12:19:39
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 爱加Audrey at 2011-04-11 12:19:39:
我试过菌液PCR但是没P出来，质粒PCR是没问题的，而且跑的很好。想问一下，菌液PCR要注意哪些？

菌液pcr跟质粒pcr基本一样，一般把一个菌落挑到400ml培养基里摇2h就可以拿来做pcr了，取2-3ul当模板就够了，PCR程序跟质粒pcr一样
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22楼2011-04-11 12:25:04
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-11 12:25:04:
菌液pcr跟质粒pcr基本一样，一般把一个菌落挑到400ml培养基里摇2h就可以拿来做pcr了，取2-3ul当模板就够了，PCR程序跟质粒pcr一样

PCR程序跟质粒pcr一样,could you please give a pcr protocol  for plasmid?

thanks very much
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23楼2011-04-11 20:43:03
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zxy664063437

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不酶切，可以跑出来的，我跑过，但是条带大小和目的片段的大小不一样
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24楼2012-04-24 20:32:08
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beatrice1018

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-06 12:20:36
用你的引物来鉴定是没有问题的，确实单酶切之后效果会好，但得保证你的酶切位点不在PCR引物中。

个人认为你提取的质粒跑电泳是没有意义的。因为蓝白斑筛选也会有假阳性产生，特别是用pMD-18T载体，比20T的效果好 ...

亲，我们做实验时遇到了菌落PCR有目的条带，但是摇菌提质粒时没有目的条带，而是在1000bp以下有不成条带的白色亮区的现象（我不大会描述······），求解答！
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25楼2014-05-06 15:17:06
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zyxme8楼
2011-04-06 17:11   回复  
宁夏808311楼
2011-04-07 07:48   回复  
祝福
zyxme16楼
2011-04-08 07:00   回复  
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