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wangy0908

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】质粒DNA可以不通过酶切直接跑电泳检测吗？

我最近做克隆，提取质粒DNA后，直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA，想看看是否是阳性的克隆，可是怎么也扩增不出来，所以第一个问题是请教各位：是否可以用这样的引物来扩增？我个人感觉理论上是可以的！
其次是，我的质粒DNA是不是有问题，也会导致这样的情况，那么就想请教质粒DNA是否不需要经过酶切而直接跑电泳检测呢？
以及如何来检测阳性克隆是做好的方法？谢谢大家

我筛选单菌落是用的IPTG和X-GOL，也就是挑选白色的单菌落后培养提取质粒DNA！
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1楼 2011-04-06 10:12:33
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
wangy0908(金币+5): 谢谢，学习不少。呵呵 2011-04-07 10:40:01
dhd997(金币+3): 专业 2011-04-08 08:49:43
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-07 07:18:00:
我没有进行酶切，就直接跑的PCR，怎么也扩增不出来。我用的是pGEM-T载体。
谢谢。还想问问，如果不酶切跑PCR，能跑出来的吗？因为如果能跑出来的话，我就觉得我的质粒DNA是肯定有问题了，就得重新再做链接以及 ...

不酶切是可以直接作为模板进行PCR反应的。PCR过程需要加入阳性和阴性对照，如果你确定没有其他方面的问题，真的可能就是你的质粒有问题。

可以再做连接转化，重新筛选。

祝好运！
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12楼2011-04-07 09:12:12
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whilecy

银虫 (初入文坛)
虽然不懂，但觉得你的研究很有前途，路过~
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2楼2011-04-06 10:24:21
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4): 鼓励 2011-04-06 14:06:25
wangy0908(金币+10): 2011-04-06 20:58:11
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆，提取质粒DNA后，直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA，想看看是否是阳性的克隆，可是怎么也扩增不出来，所以第一个问题是请教各位：是否可以用这样的引物来扩增？我个人感觉理论上是可以的！ ...

直接用是可以的，只要引物3‘和模板匹配较好就可以了，建议PCR时质粒模板先单酶切处理，这样PCR容易。质粒电泳如果看大小的话最好单酶切处理，不酶切的话电泳表现分子大小与实际大小有差别的。
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3楼2011-04-06 10:43:17
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
1949stone(EPI+1): 学习下 2011-04-06 14:07:00
wangy0908(金币+20): 2011-04-06 20:59:17
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-04-06 10:12:33:
我最近做克隆，提取质粒DNA后，直接用以前扩增目的条带的引物来扩增质粒DNA，想看看是否是阳性的克隆，可是怎么也扩增不出来，所以第一个问题是请教各位：是否可以用这样的引物来扩增？我个人感觉理论上是可以的！ ...

用你的引物来鉴定是没有问题的，确实单酶切之后效果会好，但得保证你的酶切位点不在PCR引物中。

个人认为你提取的质粒跑电泳是没有意义的。因为蓝白斑筛选也会有假阳性产生，特别是用pMD-18T载体，比20T的效果好差一些，当然价格上也便宜一些。lz的情况应该是假阳性克隆，最好不要单独根据颜色来筛选，可以采用菌落PCR先初步鉴定，然后摇菌提质粒，得到质粒后可以PCR，最好也单酶切后电泳来鉴定。不酶切直接跑电泳可能出现的情况比较复杂，不好判断。
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4楼2011-04-06 12:20:36
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