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czzcgl19

新虫 (初入文坛)

[求助] 奇怪的质粒酶切

大家好!我把含kpni和smai酶切位点的目的基因插入pgm-t载体,双酶切后目的片段很暗,几乎看不到,而且在切割后质粒附近还有一条较亮的带;尝试单酶切,出现两条带,一条和插入目的基因后质粒长度一致,另一条却比它还要长,换用其它的酶,结果还是一样,很怪异。已经做了两个月了,尝试了各种方法,结果都不理想,大家有什么好办法吗?谢谢!
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩gy好人 2013-11-10 13:59:03
czzcgl19: 金币+2, 有帮助 2013-11-16 18:53:04
含目的基因插入pgm-t载体送去测序了吗?可以测个序看下这两个位点在不在,或者你的目的基因有没有插入到pGM-T载体中

或者你有没有尝试用其他的酶切位点在验证

或者通过PCR的方法?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-11-09 17:23:17
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czzcgl19

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-09 17:23:17
含目的基因插入pgm-t载体送去测序了吗?可以测个序看下这两个位点在不在,或者你的目的基因有没有插入到pGM-T载体中

或者你有没有尝试用其他的酶切位点在验证

或者通过PCR的方法?

测过序了,没有问题。而且我用切pgm-t上面的酶切位点,也是一样的结果,都是单酶切出现两条带;听师兄说可能存在二级结构,95度处理后在酶切,还是一样。实在是没有办法了
3楼2013-11-09 17:27:26
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★
czzcgl19: 金币+2, 有帮助 2013-11-16 18:53:26
你是想用KpnI和SmaI这两个酶把目的片段从pGE-T上切下来装其他载体吗?
如果是的话,你是否考虑过换种方法做这个克隆?你可以用含有KpnI和SmaI的引物PCR,产物回收后直接用KpnI酶切,不需要加SmaI,因为SmaI是个平末端酶,然后你的目标载体进行正常的双酶切,然后连接就可以了
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-11-10 16:15:34
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kehan777

木虫 (小有名气)

重新用软件分析一下,你的质粒和目的片段
5楼2013-11-10 17:48:54
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