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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 奇怪的质粒酶切
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czzcgl19

新虫 (初入文坛)

[求助] 奇怪的质粒酶切

大家好！我把含kpni和smai酶切位点的目的基因插入pgm-t载体，双酶切后目的片段很暗，几乎看不到，而且在切割后质粒附近还有一条较亮的带；尝试单酶切，出现两条带，一条和插入目的基因后质粒长度一致，另一条却比它还要长，换用其它的酶，结果还是一样，很怪异。已经做了两个月了，尝试了各种方法，结果都不理想，大家有什么好办法吗？谢谢！
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1楼 2013-11-09 17:20:56
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩gy好人 2013-11-10 13:59:03
czzcgl19: 金币+2, ★有帮助 2013-11-16 18:53:04
含目的基因插入pgm-t载体送去测序了吗？可以测个序看下这两个位点在不在，或者你的目的基因有没有插入到pGM-T载体中

或者你有没有尝试用其他的酶切位点在验证

或者通过PCR的方法？
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2楼2013-11-09 17:23:17
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czzcgl19

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-09 17:23:17
含目的基因插入pgm-t载体送去测序了吗？可以测个序看下这两个位点在不在，或者你的目的基因有没有插入到pGM-T载体中

或者你有没有尝试用其他的酶切位点在验证

或者通过PCR的方法？

测过序了，没有问题。而且我用切pgm-t上面的酶切位点，也是一样的结果，都是单酶切出现两条带；听师兄说可能存在二级结构，95度处理后在酶切，还是一样。实在是没有办法了
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3楼2013-11-09 17:27:26
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★
czzcgl19: 金币+2, ★有帮助 2013-11-16 18:53:26
你是想用KpnI和SmaI这两个酶把目的片段从pGE-T上切下来装其他载体吗？
如果是的话，你是否考虑过换种方法做这个克隆？你可以用含有KpnI和SmaI的引物PCR，产物回收后直接用KpnI酶切，不需要加SmaI，因为SmaI是个平末端酶，然后你的目标载体进行正常的双酶切，然后连接就可以了
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4楼2013-11-10 16:15:34
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kehan777

木虫 (小有名气)
重新用软件分析一下，你的质粒和目的片段
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5楼2013-11-10 17:48:54
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