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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组质粒单双酶切结果一样，奇怪了的……
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Marado

金虫 (正式写手)

[交流] 重组质粒单双酶切结果一样，奇怪了的……

重组的表达质粒，上面只有一个BamH I与一个Not I，表达载体大小为将近5kb，目的片段700多点bp.
求解！序列是没有问题的，比对过了，没有突变.

酶切.jpg
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1楼 2012-12-06 10:29:07
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wccc

银虫 (小有名气)
★
Marado(金币+1): 谢谢参与
是不是酶有问题了？或者酶的buffer不对?换个酶切前后顺序试试吧……
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3楼2012-12-06 13:39:45
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倾听世界0721

金虫 (小有名气)
★
Marado(金币+1): 谢谢参与
你确定只有一个BamHI酶切位点吗？这样看好像是有两个BamHI酶切位点，把你的序列放到WebCutter上看看试试，会不会漏掉了什么位点。
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4楼2012-12-06 13:45:53
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Marado

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 倾听世界0721 at 2012-12-06 13:45:53
你确定只有一个BamHI酶切位点吗？这样看好像是有两个BamHI酶切位点，把你的序列放到WebCutter上看看试试，会不会漏掉了什么位点。

非常确定！
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5楼2012-12-06 14:09:35
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labbench

新虫 (小有名气)
★
Marado(金币+1): 谢谢参与
测序了再确定好不好！现在测序那么便宜~
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6楼2012-12-06 14:28:02
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desheng101

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
Marado(金币+1): 谢谢参与
Marado: 金币+2 2012-12-06 16:23:20
按照楼主说得载体将近5000，目的700，你酶切条带倒是符合。单酶切和双酶切都一样是不是有一个酶没发挥作用？
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7楼2012-12-06 15:05:18
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hzlatqh

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
Marado(金币+1): 谢谢参与
Marado: 金币+2 2012-12-06 16:22:54
要是序列没错的话，那就是酶污染了？为什么不做一个NotI单酶切看看呢
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Marado
8楼2012-12-06 15:50:26
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Marado

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by hzlatqh at 2012-12-06 15:50:26
要是序列没错的话，那就是酶污染了？为什么不做一个NotI单酶切看看呢

果然酶污染了，换了一管，正常了
还是你回答的比较对头
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9楼2012-12-06 16:21:57
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zhengli123

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得可能是你的片段里有两个BamHI酶切位点，并且这两个位点的长度也大概在700bp左右
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10楼2012-12-07 09:40:42
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Marado

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zhengli123 at 2012-12-07 09:40:42
我觉得可能是你的片段里有两个BamHI酶切位点，并且这两个位点的长度也大概在700bp左右

是酶污染了………………两管酶被混了……
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11楼2012-12-07 09:58:20
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吉林农大

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by Marado at 2012-12-06 16:21:57
果然酶污染了，换了一管，正常了
还是你回答的比较对头...

想请问一下，请问你BamH I和Not I用的是哪个公司的，后来进行的是双酶切吗，酶切效果理想吗，如果理想的话，我想请教一下，您的酶切体系是怎么设定的，还有温度是多少，时间是多长，谢谢了，我也用这两个酶切，可是遇到问题了，用的是Takara的酶！
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12楼2013-04-04 10:58:41
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Marado

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 吉林农大 at 2013-04-04 10:58:41
想请问一下，请问你BamH I和Not I用的是哪个公司的，后来进行的是双酶切吗，酶切效果理想吗，如果理想的话，我想请教一下，您的酶切体系是怎么设定的，还有温度是多少，时间是多长，谢谢了，我也用这两个酶切，可是 ...

我用的也是TAKARA的，酶切体系看是做验证还是做回收，一般做个20ul体系，酶都加0.5ul，质粒根据浓度加，温度37℃，一般4,5个小时就可以完全切开.
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13楼2013-04-07 08:59:10
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吉林农大

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by Marado at 2013-04-07 08:59:10
我用的也是TAKARA的，酶切体系看是做验证还是做回收，一般做个20ul体系，酶都加0.5ul，质粒根据浓度加，温度37℃，一般4,5个小时就可以完全切开....

嗯，我也是切了好几个小时，但出现过杂带切割不完整的现象，它们公司的NOT I好像不怎么活
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14楼2013-04-08 23:50:52
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Marado

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 吉林农大 at 2013-04-08 23:50:52
嗯，我也是切了好几个小时，但出现过杂带切割不完整的现象，它们公司的NOT I好像不怎么活...

他们的NOT I有时候确实不太好用.
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15楼2013-04-09 10:40:48
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小芳同学1113

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
什么原因呢  我跟你一样的情况
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16楼2022-10-16 17:23:41
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简单回复
su-b082楼
2012-12-06 12:34   回复  
Marado(金币+1): 谢谢参与
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