| 查看: 4110 | 回复: 16 | |||
[交流]
十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低
|
 我使用的载体是Pet-32a（+），宿主菌是BL21(DE3)，连接上目的基因后，提取重组质粒进行双酶切，30微升体系，酶切能看到两个条带，但目的基因被切下的条带很淡很淡，送出去测序，结果正确，但发送的报告反复说我质粒浓度很低，我进行表达后，确实表达量很不理想，用改目的基因连接到pcDNA3.1(+)上后，转化JM109，重新提取质粒，酶切使用了30微升体系，只看到载体的条带，使用了60微升体系后，目的基因的条带任然非常淡，近乎看不见，送重组菌出去测序，正反两个方向测序，却只有正一个方向有结果，表明我目的基因是连接上去了，但另一个方向测序却无结果，报告说质粒浓度太低，目的基因片段1100，测序公司为北京诺赛。求高手指点迷津，为何我质粒浓度这么低，导致酶切看不见双条带，原核表达量极低？ |
回复此楼» 猜你喜欢
求调剂
已经有3人回复
-
265求调剂
已经有4人回复
-
085700资源与环境308求调剂
已经有6人回复
-
一志愿吉林大学材料学硕321求调剂
已经有12人回复
-
286分人工智能专业请求调剂愿意跨考！
已经有3人回复
-
329求调剂
已经有5人回复
-
申请回稿延期一个月，编辑同意了。但系统上的时间没变，给编辑又写邮件了，没回复
已经有4人回复
-
材料学硕318求调剂
已经有5人回复
-
一志愿中国海洋大学，生物学，301分，求调剂
已经有6人回复
-
081700化工学硕调剂
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 纤维素酶用什么缓冲液溶解啊？
已经有10人回复
- 关于酶用量的计算
已经有6人回复
- 联系导师的疑惑--联系过两个导师，但都很模糊啊？如何是好。。。
已经有4人回复
- 求助：PCR扩增片段测序结果引物中间多出150bp的片段
已经有5人回复
- 求助 高通量测序
已经有3人回复
- PCR产物经酶切电泳后所得的基因型与测序结果不一致，是何原因？该如何处理？
已经有10人回复
- 重组质粒双酶切问题
已经有5人回复
- pcr产物测序和克隆之后重组质粒测序结果一样吗？
已经有12人回复
- BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事
已经有17人回复
- 求助：关于重组质粒目的条带丢失
已经有9人回复
- 请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。
已经有15人回复
- 【求助/交流】试剂盒提取重组质粒的A260/A280=2.08,求帮忙分析一下
已经有4人回复
- 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
已经有16人回复
- 【求助/交流】重组质粒PCR的taq酶选择！
已经有11人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
青岛高校2026招生硕士研究生
+5/825
-
海南大学化工院生物质定向转化课题组招收博士/硕士，2026年9月入学
+1/84
-
福建师范大学招收2026年化学、材料硕士3-4名
+1/80
-
华南师范大学（211）博士招生- 电子、自动化、机械、生物学、物理相关专业
+2/42
-
哈工大郑州高等研究院刘绍琴与查正宝教授课题组诚招合成生物学背景相关的优秀人才加盟
+1/34
-
湖北工业大学 生命科学与健康学院 课题组招收2026级食品/生物方向硕士
+1/32
-
上海交通大学电催化方向博后招聘-有锂电、高分子、燃料电池背景者优先
+1/31
-
海南师范大学孙元元老师招生博士，名额1~2个，2026年9月份入学（光电/光热催化方向）
+1/17
-
【深圳理工大学】院士工作站招聘博士后-电催化和有机电化学
+1/16
-
西南某211招27届博士
+1/16
-
生物技术工程+326，求调剂！
+1/9
-
【第三轮招生】澳科大诚招2026年秋季药剂学硕士研究生（3月31日下午18:00截止）
+1/9
-
【博士招生】武汉科技大学招收材料、化工、环境、冶金类2026年“申请-考核”制博士生
+1/7
-
青岛科技大学化工学院院士团队2026年拟招收全日制博士研究生1名
+1/7
-
哈尔滨工业大学招收2026年海洋科学硕士研究生
+1/5
-
中国科学院过程工程研究所助理研究员（正式职工）和博士后招聘启事
+1/4
-
易度层流质量流量控制器在气液两相循环流动实验气体定量注液中的应用与优势
+1/4
-
中国科学院地球化学研究所招科研助理
+1/1
-
西安交通大学生命学院智能化诊疗装备研究中心2026年博士生招生
+1/1
-
论文投出，祈福，求好运
+1/1
2楼2012-04-10 08:43:23
3楼2012-04-10 08:55:36
4楼2012-04-10 08:57:18
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
|
看来LZ很纠结这个质粒浓度低，呵呵！ 1）从你表述的来看，片段是连上了pET32了，测序结果也是正确的，酶切条带的亮弱直接与你提取的质粒浓度有关系，好像与酶切体系没多大关系。 2）试验中我也感觉pET系列载体copy数确实不太高，好像是中等拷贝吧，只好加大提取质粒的菌量了，从而提高质粒的浓度。 3）另外你用的BL21(DE3)是表达蛋白的宿主菌，如果你换用克隆表达宿主菌XL-1 blue或DH5a来提取质粒也许量就会多一些了。 祝实验顺利！ [ Last edited by srlee on 2012-4-11 at 12:49 ] |
5楼2012-04-10 22:17:34
6楼2012-04-11 09:39:39
7楼2012-04-11 11:02:21
8楼2012-04-11 16:40:59
9楼2012-04-11 20:34:40
龙开聪10楼2012-04-11 21:29:05
11楼2012-04-12 17:10:19
12楼2012-04-12 17:58:06
13楼2012-04-12 18:33:45
14楼2012-05-05 15:02:18
15楼2013-04-09 09:44:04
16楼2013-04-27 18:48:27
17楼2014-02-28 17:59:17
