| 查看: 3846 | 回复: 16 | |||
[交流]
十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低
|
 我使用的载体是Pet-32a（+），宿主菌是BL21(DE3)，连接上目的基因后，提取重组质粒进行双酶切，30微升体系，酶切能看到两个条带，但目的基因被切下的条带很淡很淡，送出去测序，结果正确，但发送的报告反复说我质粒浓度很低，我进行表达后，确实表达量很不理想，用改目的基因连接到pcDNA3.1(+)上后，转化JM109，重新提取质粒，酶切使用了30微升体系，只看到载体的条带，使用了60微升体系后，目的基因的条带任然非常淡，近乎看不见，送重组菌出去测序，正反两个方向测序，却只有正一个方向有结果，表明我目的基因是连接上去了，但另一个方向测序却无结果，报告说质粒浓度太低，目的基因片段1100，测序公司为北京诺赛。求高手指点迷津，为何我质粒浓度这么低，导致酶切看不见双条带，原核表达量极低？ |
回复此楼» 猜你喜欢
想换工作。大多数高校都是 评职称时 认可5年内在原单位取得的成果吗？
已经有5人回复
-
写了一篇“相变储能技术在冷库中应用”的论文，论文内容以实验为主，投什么期刊合适？
已经有6人回复
-
带资进组求博导收留
已经有10人回复
-
最近几年招的学生写论文不引自己组发的文章
已经有11人回复
-
需要合成515-64-0，50g，能接单的留言
已经有3人回复
-
中科院杭州医学所招收博士生一名（生物分析化学、药物递送）
已经有3人回复
-
临港实验室与上科大联培博士招生1名
已经有8人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 纤维素酶用什么缓冲液溶解啊？
已经有10人回复
- 关于酶用量的计算
已经有6人回复
- 联系导师的疑惑--联系过两个导师，但都很模糊啊？如何是好。。。
已经有4人回复
- 求助：PCR扩增片段测序结果引物中间多出150bp的片段
已经有5人回复
- 求助 高通量测序
已经有3人回复
- PCR产物经酶切电泳后所得的基因型与测序结果不一致，是何原因？该如何处理？
已经有10人回复
- 重组质粒双酶切问题
已经有5人回复
- pcr产物测序和克隆之后重组质粒测序结果一样吗？
已经有12人回复
- BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事
已经有17人回复
- 求助：关于重组质粒目的条带丢失
已经有9人回复
- 请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。
已经有15人回复
- 【求助/交流】试剂盒提取重组质粒的A260/A280=2.08,求帮忙分析一下
已经有4人回复
- 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
已经有16人回复
- 【求助/交流】重组质粒PCR的taq酶选择！
已经有11人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
双一流南京医科大学招计算机、AI、统计、生物信息等方向26年9月入学博士
+1/184
-
湖南师范大学蒋乐勇教授课题组招收2026届“申请-考核”制博士生
+1/175
-
中国科大化学与材料科学学院/苏州高研院刘东/熊宇杰教授团队诚聘博士后
+5/155
-
上海海洋大学与中国水产科学研究院 联合培养 学术型研究生 食品科学与工程专业
+1/78
-
坐标北京不异地
+1/76
-
坐标北京不异地
+1/71
-
Analytical Science Advances（Wiley出版社）长期征稿中...
+1/37
-
暨南大学理工学院 光子技术研究院段宣明团队申请制读博招生
+1/35
-
南科大夏海平院士-深大张平玉课题组联合招聘博士后
+1/34
-
有没有在ITO或者FTO玻璃上做好的CdS薄膜购买？
+1/31
-
北京理工大学计算材料化学课题组招聘2026年博士生/博后
+3/12
-
天津大学化学系吴立朋课题组申请考核制博士招生/博后招聘-有机化学，金属有机
+1/11
-
【博士招生】AI+材料/能源及海上能源岛方向有若干申请考核制名额
+1/11
-
天津大学化学系吴立朋课题组申请考核制博士招生/博后招聘
+1/8
-
南京林业大学”申请-考核”制学术学位博士研究生招生
+1/5
-
有多余纯化系统，20-200mm高压制备分离系统，配套齐全可对外代工、委托加工、项目合作
+1/5
-
山东大学集成电路学院博士招生1名
+1/4
-
浙江大学杨林课题组招聘药物化学与有机合成方向博士后
+1/3
-
中科院和北京工商大学招收2026博士/化学或生物背景
+1/2
-
诚招“先进材料与柔性电子（柔性储能或柔性天线）”方向联培博士生
+1/2
2楼2012-04-10 08:43:23
3楼2012-04-10 08:55:36
4楼2012-04-10 08:57:18
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
|
看来LZ很纠结这个质粒浓度低，呵呵！ 1）从你表述的来看，片段是连上了pET32了，测序结果也是正确的，酶切条带的亮弱直接与你提取的质粒浓度有关系，好像与酶切体系没多大关系。 2）试验中我也感觉pET系列载体copy数确实不太高，好像是中等拷贝吧，只好加大提取质粒的菌量了，从而提高质粒的浓度。 3）另外你用的BL21(DE3)是表达蛋白的宿主菌，如果你换用克隆表达宿主菌XL-1 blue或DH5a来提取质粒也许量就会多一些了。 祝实验顺利！ [ Last edited by srlee on 2012-4-11 at 12:49 ] |
5楼2012-04-10 22:17:34
6楼2012-04-11 09:39:39
7楼2012-04-11 11:02:21
8楼2012-04-11 16:40:59
9楼2012-04-11 20:34:40
龙开聪10楼2012-04-11 21:29:05
11楼2012-04-12 17:10:19
12楼2012-04-12 17:58:06
13楼2012-04-12 18:33:45
14楼2012-05-05 15:02:18
15楼2013-04-09 09:44:04
16楼2013-04-27 18:48:27
17楼2014-02-28 17:59:17