| 查看: 4632 | 回复: 16 | |||
[交流]
十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低
|
 我使用的载体是Pet-32a（+），宿主菌是BL21(DE3)，连接上目的基因后，提取重组质粒进行双酶切，30微升体系，酶切能看到两个条带，但目的基因被切下的条带很淡很淡，送出去测序，结果正确，但发送的报告反复说我质粒浓度很低，我进行表达后，确实表达量很不理想，用改目的基因连接到pcDNA3.1(+)上后，转化JM109，重新提取质粒，酶切使用了30微升体系，只看到载体的条带，使用了60微升体系后，目的基因的条带任然非常淡，近乎看不见，送重组菌出去测序，正反两个方向测序，却只有正一个方向有结果，表明我目的基因是连接上去了，但另一个方向测序却无结果，报告说质粒浓度太低，目的基因片段1100，测序公司为北京诺赛。求高手指点迷津，为何我质粒浓度这么低，导致酶切看不见双条带，原核表达量极低？ |
回复此楼» 猜你喜欢
内心匮乏
已经有8人回复
-
E口会评
已经有7人回复
-
不要再数国自然申请书的 filecode 的分隔符个数了
已经有19人回复
-
生命口会评
已经有13人回复
-
明天E口面上会评
已经有9人回复
-
轴手性化合物的确定
已经有5人回复
-
MSER送审了还被拒稿
已经有6人回复
-
祈祷青基必中
已经有16人回复
-
27届辽宁大学应届毕业生申博
已经有3人回复
-
关于如何从代码看上不上会
已经有23人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 纤维素酶用什么缓冲液溶解啊？
已经有10人回复
- 关于酶用量的计算
已经有6人回复
- 联系导师的疑惑--联系过两个导师，但都很模糊啊？如何是好。。。
已经有4人回复
- 求助：PCR扩增片段测序结果引物中间多出150bp的片段
已经有5人回复
- 求助 高通量测序
已经有3人回复
- PCR产物经酶切电泳后所得的基因型与测序结果不一致，是何原因？该如何处理？
已经有10人回复
- 重组质粒双酶切问题
已经有5人回复
- pcr产物测序和克隆之后重组质粒测序结果一样吗？
已经有12人回复
- BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事
已经有17人回复
- 求助：关于重组质粒目的条带丢失
已经有9人回复
- 请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。
已经有15人回复
- 【求助/交流】试剂盒提取重组质粒的A260/A280=2.08,求帮忙分析一下
已经有4人回复
- 【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～
已经有16人回复
- 【求助/交流】重组质粒PCR的taq酶选择！
已经有11人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
🙏 🙏 🙏
+5/643
-
90年 河北 回族女生 在京 诚征男友
+1/613
-
坐标广州，诚征女友
+1/226
-
重磅分享｜全链路AI材料研发闭环平台PULSE即将发布，重构新材料研发范式
+2/154
-
中国林科院微生物组学方向招聘助理研究员、博士后（有较高生物信息水平者优先）
+1/86
-
复旦大学李鹏课题组/香港理工大学马凯凯联合培养博士
+1/74
-
【重磅招聘】小巨人企业西顿高薪招聘水性树脂研发博士、硕士（广州）
+1/62
-
西安交通大学补亚忠课题组招聘博士生
+1/34
-
2027君科院博士研究生招生欢迎报考
+2/30
-
回首往事
+1/16
-
北京科技大学能源与环境工程学院 博士、博士后招聘启事
+1/16
-
中山大学孙逸仙纪念医院招收科研博士后
+1/10
-
双一流高校招收博士（现代技术管理/环境技术经济管理）及硕士研究生（长期有效）
+1/9
-
双一流高校招收博士（现代技术管理/环境技术经济管理）及硕士研究生（长期有效）
+1/7
-
出国留学的目的是什么？
+1/4
-
双一流高校招收博士（现代技术管理/环境技术经济管理）及硕士研究生（长期有效）
+1/4
-
面上祈福
+1/2
-
评职称 / 毕业赶进度，期刊发表选刊、审稿节奏问题可交流答疑
+1/1
-
香港科技大学（广州）收水文学方向科研助理/全奖博士
+1/1
-
国家纳米中心招聘项目聘用研究助理
+1/1
2楼2012-04-10 08:43:23
3楼2012-04-10 08:55:36
4楼2012-04-10 08:57:18
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32
|
看来LZ很纠结这个质粒浓度低，呵呵！ 1）从你表述的来看，片段是连上了pET32了，测序结果也是正确的，酶切条带的亮弱直接与你提取的质粒浓度有关系，好像与酶切体系没多大关系。 2）试验中我也感觉pET系列载体copy数确实不太高，好像是中等拷贝吧，只好加大提取质粒的菌量了，从而提高质粒的浓度。 3）另外你用的BL21(DE3)是表达蛋白的宿主菌，如果你换用克隆表达宿主菌XL-1 blue或DH5a来提取质粒也许量就会多一些了。 祝实验顺利！ [ Last edited by srlee on 2012-4-11 at 12:49 ] |
5楼2012-04-10 22:17:34
6楼2012-04-11 09:39:39
7楼2012-04-11 11:02:21
8楼2012-04-11 16:40:59
9楼2012-04-11 20:34:40
龙开聪10楼2012-04-11 21:29:05
11楼2012-04-12 17:10:19
12楼2012-04-12 17:58:06
13楼2012-04-12 18:33:45
14楼2012-05-05 15:02:18
15楼2013-04-09 09:44:04
16楼2013-04-27 18:48:27
17楼2014-02-28 17:59:17