24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

龙开聪

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 2631.3
帖子: 76
在线: 74.6小时
虫号: 1250816

[交流] 十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低

我使用的载体是Pet-32a（+），宿主菌是BL21(DE3)，连接上目的基因后，提取重组质粒进行双酶切，30微升体系，酶切能看到两个条带，但目的基因被切下的条带很淡很淡，送出去测序，结果正确，但发送的报告反复说我质粒浓度很低，我进行表达后，确实表达量很不理想，用改目的基因连接到pcDNA3.1(+)上后，转化JM109，重新提取质粒，酶切使用了30微升体系，只看到载体的条带，使用了60微升体系后，目的基因的条带任然非常淡，近乎看不见，送重组菌出去测序，正反两个方向测序，却只有正一个方向有结果，表明我目的基因是连接上去了，但另一个方向测序却无结果，报告说质粒浓度太低，目的基因片段1100，测序公司为北京诺赛。

求高手指点迷津，为何我质粒浓度这么低，导致酶切看不见双条带，原核表达量极低？

回复此楼

» 猜你喜欢

北京211副教授，35岁，想重新出发，去国外做博后，怎么样？已经有4人回复
自荐读博已经有3人回复
求助:我三月中下旬出站，青基依托单位怎么办？已经有5人回复
论文终于录用啦！满足毕业条件了已经有22人回复
不自信的我已经有5人回复
磺酰氟产物，毕不了业了！已经有4人回复
投稿Elsevier的杂志（返修），总是在选择OA和subscription界面被踢皮球已经有8人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

纤维素酶用什么缓冲液溶解啊？已经有10人回复
关于酶用量的计算已经有6人回复
联系导师的疑惑--联系过两个导师，但都很模糊啊？如何是好。。。已经有4人回复
求助：PCR扩增片段测序结果引物中间多出150bp的片段已经有5人回复
求助高通量测序已经有3人回复
PCR产物经酶切电泳后所得的基因型与测序结果不一致，是何原因？该如何处理？已经有10人回复
重组质粒双酶切问题已经有5人回复
pcr产物测序和克隆之后重组质粒测序结果一样吗？已经有12人回复
BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事已经有17人回复
求助：关于重组质粒目的条带丢失已经有9人回复
请教重组质粒快检的具体方法以及原理。。。。已经有15人回复
【求助/交流】试剂盒提取重组质粒的A260/A280=2.08,求帮忙分析一下已经有4人回复
【求助/交流】关于重组质粒的构建，总是失败，希望高手指点一下啊～～已经有16人回复
【求助/交流】重组质粒PCR的taq酶选择！已经有11人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2012-04-10 08:20:47

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

srlee

铁杆木虫 (小有名气)

应助: 11 (小学生)
金币: 4485.7
帖子: 218
在线: 508.4小时
虫号: 802845

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
龙开聪: 金币+7, 谢谢，这两天做实验去了，都没空登陆论坛，建议不错，受益不浅 2012-04-12 17:03:32

看来LZ很纠结这个质粒浓度低，呵呵！
1）从你表述的来看，片段是连上了pET32了，测序结果也是正确的，酶切条带的亮弱直接与你提取的质粒浓度有关系，好像与酶切体系没多大关系。
2）试验中我也感觉pET系列载体copy数确实不太高，好像是中等拷贝吧，只好加大提取质粒的菌量了，从而提高质粒的浓度。
3）另外你用的BL21(DE3)是表达蛋白的宿主菌，如果你换用克隆表达宿主菌XL-1 blue或DH5a来提取质粒也许量就会多一些了。
祝实验顺利！

[ Last edited by srlee on 2012-4-11 at 12:49 ]

赞一下