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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

[交流] BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事 已有4人参与

最近构建了两个脂肪酶重组质粒，分别转入BL21(DE3)中表达，诱导前菌体颜色一样，加入终浓度0.1mM IPTG 15℃诱导24h后，离心菌体，其中一个的菌体颜色为正常的大肠杆菌色（颜色略偏淡黄些），而另一个菌体就偏白色了，破碎后不是那种呈澄清状，而是有点呈乳白色，离心后沉淀比另一个多。这个质粒已经这样摇过好几次了，结果都是一样，这次是重新连接后再转了一次新买的BL21。两只里同源性很高，跑过蛋白电泳，可溶性蛋白量差不多的。另外也排除染菌的可能了。请各位高手分析下什么原因。谢谢
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
1楼 2011-06-29 14:21:18
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
看天(金币+5, BioEPI+1): 鼓励交流 2011-12-21 12:43:24
引用回帖:
11楼: Originally posted by bmby at 2011-11-05 12:36:39:
扩增的基因如果和你测序序列不一样，需要突变回去吗？
你用的什么载体？可溶性蛋白量大吗？酶活呢？
大肠杆菌表达会形成难溶的蛋白或者无活性的包涵体，怎样避免这种问题？
是将脂肪酶基因突变改造一下吗，还 ...

你扩增基因的时候用高保真性好的酶几乎是不会突变的。我用PET21a表达的，BL21DE3，蛋白可溶性很大，还可以胞外分泌，酶活也很高的。其实与酶的本身性质关系比较大，有的很好表达，有的就很难表达，我有很多条与我这条已表达的同源性在60%以下，表达就全是包涵体，换酵母以及采用分子伴侣等方法也试过，几乎可溶性都很低的，我觉得突变的话也可以，前段时间做过易错PCR，但觉得效果不太明显
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
12楼2011-11-05 13:48:53
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普通回帖

gwbk

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
楼主很帅，赞赏一个
高手在潜水，慢慢等
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2楼2011-06-29 16:50:15
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gwbk

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你的帖子要沉了，高手高手~~~
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3楼2011-06-30 00:27:58
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original900

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
请问楼主构建的两个脂肪酶重组质粒，这两个质粒中的脂肪酶基因是从什么菌株中获取的，有什么特殊性质吗？我也在构建脂肪酶基因工程菌，所以有此一问！
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4楼2011-07-21 15:16:02
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by original900 at 2011-07-21 15:16:02:
请问楼主构建的两个脂肪酶重组质粒，这两个质粒中的脂肪酶基因是从什么菌株中获取的，有什么特殊性质吗？我也在构建脂肪酶基因工程菌，所以有此一问！

我的脂肪酶基因都是来自环境土壤宏基因组中的，现在它的酶学性质快表征完了，有一些独特的性质。
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5楼2011-07-21 15:28:13
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
能弄到酶就行了，其它的都不是重点。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2011-07-21 20:15:58
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bmby

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2011-07-21 15:28:13:
我的脂肪酶基因都是来自环境土壤宏基因组中的，现在它的酶学性质快表征完了，有一些独特的性质。

从环境土壤宏基因组中克隆的话，是先建文库筛选吗？
你是怎样设计克隆引物的？
最近也在做这个，希望能向你学习下。
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7楼2011-11-04 17:49:34
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
看天(金币+3): 鼓励一下 求助反而应助 2011-12-21 12:42:53
引用回帖:
7楼: Originally posted by bmby at 2011-11-04 17:49:34:
从环境土壤宏基因组中克隆的话，是先建文库筛选吗？
你是怎样设计克隆引物的？
最近也在做这个，希望能向你学习下。

我是先建Fosmid文库，然后直接功能筛选获得阳性克隆，这样直接获得全长基因。
不知你所说的设计克隆引物是指什么？，是获得全长基因后设计全长基因两端的引物还是根据全长基因设计中间部分片段的引物？
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
8楼2011-11-04 21:49:38
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bmby

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2011-11-04 21:49:38:
我是先建Fosmid文库，然后直接功能筛选获得阳性克隆，这样直接获得全长基因。
不知你所说的设计克隆引物是指什么？，是获得全长基因后设计全长基因两端的引物还是根据全长基因设计中间部分片段的引物？

是说设计全长基因两端的引物。
你应该是先测序，再根据序列设计引物吗？
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9楼2011-11-05 09:14:33
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by bmby at 2011-11-05 09:14:33:
是说设计全长基因两端的引物。
你应该是先测序，再根据序列设计引物吗？

是的，先测序后再设计全长引物，在引物两端加上酶切位点，扩增出我的目的基因后，然后去连接其他载体进行表达
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10楼2011-11-05 09:59:45
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