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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

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[交流] BL21(DE3)表达脂肪酶重组质粒，将菌体颜色偏白是是怎么回事已有4人参与

最近构建了两个脂肪酶重组质粒，分别转入BL21(DE3)中表达，诱导前菌体颜色一样，加入终浓度0.1mM IPTG 15℃诱导24h后，离心菌体，其中一个的菌体颜色为正常的大肠杆菌色（颜色略偏淡黄些），而另一个菌体就偏白色了，破碎后不是那种呈澄清状，而是有点呈乳白色，离心后沉淀比另一个多。这个质粒已经这样摇过好几次了，结果都是一样，这次是重新连接后再转了一次新买的BL21。两只里同源性很高，跑过蛋白电泳，可溶性蛋白量差不多的。另外也排除染菌的可能了。请各位高手分析下什么原因。谢谢

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gwbk

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人生百态原为海，看破红尘方为岸！

1楼 2011-06-29 14:21:18

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jinpeng_6118

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看天(金币+5, BioEPI+1): 鼓励交流 2011-12-21 12:43:24

引用回帖:

11楼: Originally posted by bmby at 2011-11-05 12:36:39:
扩增的基因如果和你测序序列不一样，需要突变回去吗？
你用的什么载体？可溶性蛋白量大吗？酶活呢？
大肠杆菌表达会形成难溶的蛋白或者无活性的包涵体，怎样避免这种问题？
是将脂肪酶基因突变改造一下吗，还 ...

你扩增基因的时候用高保真性好的酶几乎是不会突变的。我用PET21a表达的，BL21DE3，蛋白可溶性很大，还可以胞外分泌，酶活也很高的。其实与酶的本身性质关系比较大，有的很好表达，有的就很难表达，我有很多条与我这条已

表达的同源性在60%以下，表达就全是包涵体，换酵母以及采用分子伴侣等方法也试过，几乎可溶性都很低的，我觉得突变的话也可以，前段时间做过易错PCR，但觉得效果不太明显