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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 用LB培养BL21(DE3)菌体总是死亡，求助！
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朱星星

银虫 (小有名气)

[求助] 用LB培养BL21(DE3)菌体总是死亡，求助！ 已有8人参与

我最近做原核表达，用BL21(DE3)，质粒PET32，我用保存的菌株划板、挑斑活化，用LB在37℃加氨苄培养，刚开始菌体扩增，可是过两个小时后总是死亡（由之前的乳黄状变成带渣滓的清澈状）。我没有加IPTG，只是纯粹扩增，最近总是这样。
同时做的其他蛋白都这样，而且之前做的挺好，说明不是毒蛋白的原因，而且活化的菌株应该没问题，因为刚开始我小量诱导很正常，四度保存过几天慢慢就不好了。有时候刚刚挑的斑也会摇不起来。LB我们都不调pH，之前做的挺好，我换了各种公司的去离子水，应该排除水质问题。各位大虾有没有遇到过类似情况的。
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1楼 2014-02-25 11:53:06
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zheng1993

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
难道是有噬菌体了吗
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5楼2014-02-25 14:27:26
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ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
觉得这种问题可能是出在培养基组分上。酵母提取物和胰蛋白胨可以考虑换新的
至于其他的，看你们那问题还真不少。但是如果连细菌都养不活这个有些不能容忍了，很不专业了。
LB是不需要调pH的。我们这边都是按照分子克隆教材上的配方4g蛋白胨，2g酵母提取物，2g NaCl加400mL水，121°C 20min。
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2楼2014-02-25 12:12:10
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liuwuwsu3

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是质粒不稳定，或者已经丢了。你试试不加抗生素，如果能长，就不是培养基问题。
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3楼2014-02-25 12:47:10
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朱星星

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ifyousee at 2014-02-25 12:12:10
觉得这种问题可能是出在培养基组分上。酵母提取物和胰蛋白胨可以考虑换新的
至于其他的，看你们那问题还真不少。但是如果连细菌都养不活这个有些不能容忍了，很不专业了。
LB是不需要调pH的。我们这边都是按照分子 ...

培养基应该没问题，我们全部用进口新的，我们天天摇克隆菌都没问题，最近只有我做蛋白，年前年后都会出现这种情况。
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4楼2014-02-25 14:11:31
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朱星星

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zheng1993 at 2014-02-25 14:27:26
难道是有噬菌体了吗

我之前一直怀疑有噬菌体，如果这样怎么去降低影响呢？紫外灯充分照LB？
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6楼2014-02-25 17:35:05
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zheng1993

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 朱星星 at 2014-02-25 17:35:05
我之前一直怀疑有噬菌体，如果这样怎么去降低影响呢？紫外灯充分照LB？...

甲醛熏蒸一晚上即可
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7楼2014-02-26 12:36:13
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你太善良

新虫 (著名写手)
我最近也遇到这样的问题，请问你解决了吗
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8楼2014-03-26 12:13:50
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julialv23

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问您的问题解决了吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2014-07-26 09:30:25
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by julialv23 at 2014-07-26 09:30:25
请问您的问题解决了吗？

既然还有质粒，重新转化就是啦

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2014-07-26 13:35:20
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