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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » gst标签蛋白的表达和纯化
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wapw1987

新虫 (小有名气)

[求助] gst标签蛋白的表达和纯化

有没有高人做过GST标签的蛋白的表达和纯化，能不能给点建议，我用的是pGEX质粒，需要在什么菌株中表达，纯化时用什么方法收集提纯呢？
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1楼 2011-12-24 09:50:11
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回帖置顶 ( 共有1个 )

hwamg

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wapw1987: 回帖置顶 2011-12-25 15:12:27
wapw1987(金币+2): ★★★★★最佳答案 2011-12-25 15:31:24
linyingjia(金币+5, BioEPI+1, 专家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24
1.        转8ml过夜小摇菌液接入800ml含氨苄的LB培养基（2L锥形瓶）, 37度摇菌至OD600至 0.6。
2.        诱导前取1ml菌液，也可使用转入其它质粒的未诱导的BI21菌株作对照。
这是没有诱导的对照，5000rpm，5min去上清，菌体用50 μl SDS loading buffer重悬，放置于－20度备用。
3.        加IPTG诱导蛋白表达，使其中浓度达0.1mM。
4.        室温诱导过夜（8小时左右），取1ml菌液。
这是诱导后的对照，5000rpm，5min去上清，菌体用100μl SDS loading buffer重悬，放置于－20度备用。
5.        使用冷冻离心机4000g，4度离心20分钟，去上清。（除去LB培养基）
6.        将-20度保存的菌体放在冰上15min，用lysis buffer重悬。（1g菌体用2到5ml lysis buffer）
7.        加溶菌酶，使其终浓度达1mg/ml，放置于冰上30min。
8.        超声破碎细胞（冰上进行），工作2s停1s，60s每循环，重复四次。
9.        10000g，4度离心30min。
11. 从上清中取出20μl，加5μl SDS loading buffer，放置于－20度备用。
Beads的预处理：
1）        将600μl 50％的Ni-NTA slurry/ Glutation Sepharose 4B加入层析柱，打开底部的的盖子，除去酒精。
2）        4ml 无菌水洗柱3－4次（间隔：4度 rotate10min）
3）        Lysis buffer 洗柱2次（同上）
12. 将剩余裂解液加0.3ml beads，4度冰箱rotate 2hr。
13. 装柱
14. 用4ml Wash buffer洗beads（目的是洗掉非特异吸附），4度冰箱rotate 10min，重复洗四次，最后一次离心留少许上清。（因为有可能beads对融合蛋白的结合不强，所以每一步都保留上清）
每次洗脱都要取20 μl，加5μl 5*SDS loading buffer。放置于－20度备用。
15. 使用300μl Elution buffer洗柱（可根据情况，适量增加洗脱体积），4度冰箱rotate 10min，重复洗四次，每次都用一个EP管接收。分析每次洗脱的蛋白量，实验要在冰上进行。
每次洗脱都要取5μl，加5μl 2*SDS loading buffer，放置于－20度备用。
16. 10％SDS PAGE检测。
17. 检测蛋白浓度
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4楼2011-12-25 01:02:41
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普通回帖

Dionysius

木虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-12-24 17:29:33
我们表达一般都用BL21菌株，很多生物公司都有蛋白提纯的产品，自己去查一下

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2011-12-24 10:14:02
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xhjggl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以用GST-SefinoseTM  Resin  BSP031-1
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3楼2011-12-24 21:17:50
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hwamg

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我从头到尾做过一遍，友情提醒：以上是我们实验室的传到我这里的protocol，如果你要得到高浓度的蛋白，可以用适量的lysis buffer 重悬，最后洗脱rotate20min
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5楼2011-12-25 01:05:15
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wapw1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by hwamg at 2011-12-25 01:02:41:
1.        转8ml过夜小摇菌液接入800ml含氨苄的LB培养基（2L锥形瓶）, 37度摇菌至OD600至 0.6。
2.        诱导前取1ml菌液，也可使用转入其它质粒的未诱导的BI21菌株作对照。
这是没有诱导的对照，5000rpm，5min去上清，菌体 ...

请问用的什么公司的柱子分离蛋白的？破碎细菌的那些液体是随柱子一起的吗？
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6楼2011-12-25 15:32:26
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落明逐暗

金虫 (正式写手)

好吃嘴班班长
菌株就是BL21，一般没什么问题。诱导表达的话视蛋白不同，达到最大量的时候也不同，建议自己做一下表达量曲线确定最佳时间，我是在诱导6小时后收菌。高压破碎后离心取上清和沉淀进行电泳，确定表达部位后，如果在上清（即可溶性表达），那就以上清上样至GE公司的GST SEPHAROSE 4B的柱子，进行纯化。亲和纯化流速慢一点比较好。
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天涯静处无征战，兵气销为日月光。
7楼2011-12-26 13:21:52
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
别人的都是参考    应该根据自己的适当调整
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8楼2011-12-27 20:30:47
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wapw1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 落明逐暗 at 2011-12-26 13:21:52:
菌株就是BL21，一般没什么问题。诱导表达的话视蛋白不同，达到最大量的时候也不同，建议自己做一下表达量曲线确定最佳时间，我是在诱导6小时后收菌。高压破碎后离心取上清和沉淀进行电泳，确定表达部位后，如果在 ...

表达量曲线怎么做啊，太麻烦了吧，蛋白怎么提？还是测总蛋白代替？
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9楼2011-12-30 09:38:30
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落明逐暗

金虫 (正式写手)

好吃嘴班班长
其实很简单的，就是隔一个小时或者两个小时取1ml菌液，离心得菌体后直接SDSPAGE上样buffer重悬，然后沸水浴5min，取适量上样，看蛋白大小处的条带量就大概知道了，不复杂。
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天涯静处无征战，兵气销为日月光。
10楼2011-12-30 09:54:43
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