| 查看: 5183 | 回复: 17 | |||
| 本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
wapw1987新虫 (小有名气)
|
[求助]
gst标签蛋白的表达和纯化
|
||
| 有没有高人做过GST标签的蛋白的表达和纯化，能不能给点建议，我用的是pGEX质粒，需要在什么菌株中表达，纯化时用什么方法收集提纯呢？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
估计是周四
已经有3人回复
-
基金啊基金
已经有3人回复
-
科研孤儿太难了
已经有15人回复
-
让我中一个面上吧！
已经有10人回复
-
言之凿凿，明天官网会通知放榜？
已经有17人回复
-
时间戳又变了
已经有17人回复
-
今天系统多次维护，明天很可能放榜！
已经有11人回复
-
时间戳变了，能看出什么问题？
已经有23人回复
-
只有每年这种时候来逛逛小木虫
已经有22人回复
-
放榜前的不淡定
已经有12人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- GST标签树脂蛋白纯化说明书
已经有107人回复
- GST融合蛋白表达纯化
已经有5人回复
- 蛋白互作必会，GST纯化遇到的问题
已经有13人回复
- gst标签，蛋白纯化
已经有25人回复
- GST融合蛋白纯化求助 ！！！
已经有19人回复
- 【求助/交流】原核表达蛋白分子量偏大
已经有17人回复
- 【求助/交流】带GST标签的重组蛋白的纯化？
已经有14人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌中蛋白表达量偏低，大家有什么建议？
已经有28人回复
- 【求助/交流】谁知道如何去除GST标签啊，帮帮忙啊，急！
已经有4人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wapw1987: 回帖置顶 2011-12-25 15:12:27
wapw1987(金币+2): ★★★★★最佳答案 2011-12-25 15:31:24
linyingjia(金币+5, BioEPI+1, 专家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24
感谢参与，应助指数 +1
wapw1987: 回帖置顶 2011-12-25 15:12:27
wapw1987(金币+2): ★★★★★最佳答案 2011-12-25 15:31:24
linyingjia(金币+5, BioEPI+1, 专家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24
|
1. 转8ml过夜小摇菌液接入800ml含氨苄的LB培养基（2L锥形瓶）, 37度摇菌至OD600至 0.6。 2. 诱导前取1ml菌液，也可使用转入其它质粒的未诱导的BI21菌株作对照。 这是没有诱导的对照，5000rpm，5min去上清，菌体用50 μl SDS loading buffer重悬，放置于－20度备用。 3. 加IPTG诱导蛋白表达，使其中浓度达0.1mM。 4. 室温诱导过夜（8小时左右），取1ml菌液。 这是诱导后的对照，5000rpm，5min去上清，菌体用100μl SDS loading buffer重悬，放置于－20度备用。 5. 使用冷冻离心机4000g，4度离心20分钟，去上清。（除去LB培养基） 6. 将-20度保存的菌体放在冰上15min，用lysis buffer重悬。（1g菌体用2到5ml lysis buffer） 7. 加溶菌酶，使其终浓度达1mg/ml，放置于冰上30min。 8. 超声破碎细胞（冰上进行），工作2s停1s，60s每循环，重复四次。 9. 10000g，4度离心30min。 11. 从上清中取出20μl，加5μl SDS loading buffer，放置于－20度备用。 Beads的预处理： 1） 将600μl 50％的Ni-NTA slurry/ Glutation Sepharose 4B加入层析柱，打开底部的的盖子，除去酒精。 2） 4ml 无菌水洗柱3－4次（间隔：4度 rotate10min） 3） Lysis buffer 洗柱2次（同上） 12. 将剩余裂解液加0.3ml beads，4度冰箱rotate 2hr。 13. 装柱 14. 用4ml Wash buffer洗beads（目的是洗掉非特异吸附），4度冰箱rotate 10min，重复洗四次，最后一次离心留少许上清。（因为有可能beads对融合蛋白的结合不强，所以每一步都保留上清） 每次洗脱都要取20 μl，加5μl 5*SDS loading buffer。放置于－20度备用。 15. 使用300μl Elution buffer洗柱（可根据情况，适量增加洗脱体积），4度冰箱rotate 10min，重复洗四次，每次都用一个EP管接收。分析每次洗脱的蛋白量，实验要在冰上进行。 每次洗脱都要取5μl，加5μl 2*SDS loading buffer，放置于－20度备用。 16. 10％SDS PAGE检测。 17. 检测蛋白浓度 |
4楼2011-12-25 01:02:41
Dionysius
木虫 (小有名气)
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 2431.3
- 散金: 449
- 红花: 2
- 帖子: 216
- 在线: 177.7小时
- 虫号: 1546717
- 注册: 2011-12-21
- 专业: 蛋白质组学
2楼2011-12-24 10:14:02
xhjggl
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 43 (小学生)
- 金币: 2889.3
- 散金: 150
- 红花: 7
- 帖子: 556
- 在线: 190.9小时
- 虫号: 95496
- 注册: 2005-10-04
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
3楼2011-12-24 21:17:50
5楼2011-12-25 01:05:15
40