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bioinfuture

铁虫 (小有名气)


[交流] 蛋白互作必会,GST纯化遇到的问题

我在做GST表达,我的融合蛋白大小是35kDa,但是我的全菌煮后,以及超声后的上清和沉淀均出现一条26kDa的带,初步判断是GST带,可能是我的目的蛋白不适合在原核里表达,从而部分蛋白在表达在GST时就提前终止表达。因为我要做蛋白相互作用,所以需要蛋白非常纯才行。请问能用什么办法,把这个GST杂带处理掉?

谢谢
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月月大可

木虫 (著名写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
gst表达目的蛋白中出现独立独立的gst条带是常有的事情。
你用酶把目的蛋白切掉就可以了,这样就可以收获非常纯的目的蛋白。

如果你想做pulldown实验,完全没必要局限于gst标签。我当年用his tag做的,一样效果。没人规定pulldown实验必须是gst pulldown!
8楼2011-12-13 16:59:33
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huaerfeng

铁虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
his-tag pull down如何做?实验流程谁知道呢?
9楼2012-02-24 13:45:22
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xiaoqiang100

铁虫 (小有名气)


★ ★ ★
bioinfuture(金币+1):谢谢参与
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 16:48:36
首先是亲和层析吧,把杂蛋白除掉。然后通过阴/阳离子层析或者分子筛去掉GST。至于是用阴/阳离子层析,就要看目的蛋白和GST的电性的差异了。但是看两个条带的分子量差,用分子筛应该也可以。
3楼2011-09-29 14:03:23
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yang0071

木虫 (职业作家)


★ ★ ★
bioinfuture(金币+1):谢谢参与
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 16:48:47
先上GST抗体,wb出来后,如果还有杂带,再考虑纯化主带。
5楼2011-09-29 16:11:26
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小周

铁杆木虫 (著名写手)


★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 16:48:57
查一下你的载体,上面应该会有切割掉GST的蛋白酶切序列,用商业化的蛋白酶如凝血酶、肠激酶、Xa因子和烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶等,把GST切除就行了。
7楼2011-09-30 10:16:58
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)


酶切以后重新反挂GST
10楼2012-03-15 14:52:43
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)



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引用回帖:
4426849楼: Originally posted by huaerfeng at 2012-02-24 13:45:22:
his-tag pull down如何做?实验流程谁知道呢?

pull down的结果都是定性而已,而且结果假阳性太多,和实验操作有很大关系。有条件还是做一个SPR或者ITC吧
11楼2012-03-15 14:54:30
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jie8946

银虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你用的什么感受态细胞?是不是你没有进行密码子优化,导致密码子不适合在你的感受态细胞中进行表达,可以换一种感受态细胞试试。
12楼2012-03-15 17:08:47
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whiskyxy

金虫 (正式写手)



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求酶切掉GST标签的步骤
13楼2012-05-22 12:46:25
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安琪儿水晶

金虫 (正式写手)


引用回帖:
13楼: Originally posted by whiskyxy at 2012-05-22 12:46:25
求酶切掉GST标签的步骤

同求
14楼2013-07-13 19:08:27
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2011-09-29 13:59   回复  
bioinfuture(金币+1):谢谢参与
2011-09-29 14:15   回复  
bioinfuture(金币+1):谢谢参与
2011-09-30 08:21   回复  
bioinfuture(金币+1):谢谢参与
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