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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白互作必会，GST纯化遇到的问题
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bioinfuture

铁虫 (小有名气)

[交流] 蛋白互作必会，GST纯化遇到的问题

我在做GST表达，我的融合蛋白大小是35kDa，但是我的全菌煮后，以及超声后的上清和沉淀均出现一条26kDa的带，初步判断是GST带，可能是我的目的蛋白不适合在原核里表达，从而部分蛋白在表达在GST时就提前终止表达。因为我要做蛋白相互作用，所以需要蛋白非常纯才行。请问能用什么办法，把这个GST杂带处理掉？

谢谢
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1楼 2011-09-29 10:41:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
gst表达目的蛋白中出现独立独立的gst条带是常有的事情。
你用酶把目的蛋白切掉就可以了，这样就可以收获非常纯的目的蛋白。

如果你想做pulldown实验，完全没必要局限于gst标签。我当年用his tag做的，一样效果。没人规定pulldown实验必须是gst pulldown！
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8楼2011-12-13 16:59:33
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huaerfeng

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
his-tag pull down如何做？实验流程谁知道呢？
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9楼2012-02-24 13:45:22
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xiaoqiang100

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
bioinfuture(金币+1):谢谢参与
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 16:48:36
首先是亲和层析吧，把杂蛋白除掉。然后通过阴/阳离子层析或者分子筛去掉GST。至于是用阴/阳离子层析，就要看目的蛋白和GST的电性的差异了。但是看两个条带的分子量差，用分子筛应该也可以。
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3楼2011-09-29 14:03:23
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yang0071

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
bioinfuture(金币+1):谢谢参与
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 16:48:47
先上GST抗体，wb出来后，如果还有杂带，再考虑纯化主带。
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5楼2011-09-29 16:11:26
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 16:48:57
查一下你的载体，上面应该会有切割掉GST的蛋白酶切序列，用商业化的蛋白酶如凝血酶、肠激酶、Xa因子和烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶等，把GST切除就行了。
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7楼2011-09-30 10:16:58
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)
酶切以后重新反挂GST
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10楼2012-03-15 14:52:43
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
4426849楼: Originally posted by huaerfeng at 2012-02-24 13:45:22:
his-tag pull down如何做？实验流程谁知道呢？

pull down的结果都是定性而已，而且结果假阳性太多，和实验操作有很大关系。有条件还是做一个SPR或者ITC吧
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11楼2012-03-15 14:54:30
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jie8946

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用的什么感受态细胞？是不是你没有进行密码子优化，导致密码子不适合在你的感受态细胞中进行表达，可以换一种感受态细胞试试。
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12楼2012-03-15 17:08:47
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whiskyxy

金虫 (正式写手)
★
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求酶切掉GST标签的步骤
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13楼2012-05-22 12:46:25
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安琪儿水晶

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by whiskyxy at 2012-05-22 12:46:25
求酶切掉GST标签的步骤

同求
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14楼2013-07-13 19:08:27
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简单回复
认识你真好2楼
2011-09-29 13:59   回复  
bioinfuture(金币+1):谢谢参与
tianxin58594楼
2011-09-29 14:15   回复  
bioinfuture(金币+1):谢谢参与
188538508506楼
2011-09-30 08:21   回复  
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