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tjutrevor金虫 (正式写手)
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[求助]
蛋白纯化分离问题
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目前在做酶的分离纯化，报道的仅有4个相同功能的酶，但是比对后基本没有保守序列。。。 我做的菌也没有全基因组序列。。。 是不是只能一步一步纯化，直到SDS一条带？ 实验时先过阴离子交换，后过分子筛，但是效果也不好。SDS的杂带较多，但是有一条带貌似是要找的。不知切胶做N端测序可不可以？引物如何设计呢？ 还望请大牛们指点。谢谢了 |
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【答案】应助回帖
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silicare(金币+5, EPI+1): good 2011-06-03 18:16:54
tjutrevor(金币+20): 多谢！我是先硫氨沉淀的，不过没有脱盐 2011-06-05 14:38:30
silicare(金币+5, EPI+1): good 2011-06-03 18:16:54
tjutrevor(金币+20): 多谢！我是先硫氨沉淀的，不过没有脱盐 2011-06-05 14:38:30
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1、 你的菌既然没有全基因测序，那么就不能设计引物来直接克隆。 2、 如果报道的仅有4个相同功能的酶，但是比对后基本没有保守序列，那就是说你的酶纯化出来之后可能会容易发文章。 3、 蛋白质纯化是需要一步一步来的，野生酶只要一步就能纯化就很夸张。 4、 为什么要先用离子交换层析柱？无论什么方法来培养的微生物，得到的酶，都会有很多杂质，包括细胞碎片和培养基成分等等，还有一些盐，这样的酶液要用离子交换层析柱就必须先去盐，而且有一些杂质还不一定能用0.22微米的滤膜过滤去掉，所以我认为第一步可以先用某种方法来初步纯化，例如硫酸铵沉淀和小分子有机溶剂沉淀，这样能去掉很多杂质，包括一些蛋白质杂质。假如是硫酸铵沉淀，那就可以立即用疏水层析柱，假如是有机溶剂沉淀，那么下一步可以去掉小分子有机溶剂，反正也要脱盐的，盐和小分子有机溶剂都可以被除掉。这样一来就更好了。 5、 凝胶过滤的效率是比较差的，不到不得已就别用，而且要求上样的样品体积要小，在缩小体积这一步说不定会损失蛋白质，说不定你的酶也有损失。 6、 既然条带很多，那就说明你要的那条带说不定也不纯，打质谱都可能打不出来，测序也一样可能测不出来，还是先纯一点再考虑切胶保险。 |
4楼2011-06-03 01:12:15
【答案】应助回帖
★ ★ ★
silicare(金币+3): 鼓励交流 2011-06-03 18:18:13
silicare(金币+3): 鼓励交流 2011-06-03 18:18:13
| 谈下俺的建议。。我感觉首先应该先按照分子量先过一个分子筛。。粗分下符合分子量范围的蛋白。。然后再过阴离子（当然是根据您蛋白的性质）进行细分。。如果离子交换分的还不干净的话。。来个强阴离子交换。。先阴离子的话我感觉。。毕竟载量有限。。杂蛋白很多。。可能你的目的蛋白结合效果不会太好。。会有较多浪费。。不如先分子筛再离子交换。。至于测序的问题。。N端的蛋白测序好像不用设计引物捏。。质谱好像就行。。当然N端的10个之内好像挺准（价钱好像也不贵捏）。。太多恐怕就信号不太强了。。。不知道你这个左右的氨基酸能否作为鉴别标准。。 |
5楼2011-06-03 11:37:28
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2楼2011-06-02 18:41:20
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3楼2011-06-02 19:23:19
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silicare(金币+3): 鼓励交流 2011-06-03 18:18:05
silicare(金币+3): 鼓励交流 2011-06-03 18:18:05
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我不建议第一步就是分子筛，理由是 1、分子量还不知道是多少，因为已经报道的基因没有同源性，不能依靠这个来估计自己的酶的同源性。当然如果能测定酶活力的话也不存在这个问题。 2、粗酶液里杂质较多，如果一下子把体积浓缩到很小，那么杂质会沉淀，会带动一部分酶也共沉淀，造成损失。 3、如果用离子交换层析，即使蛋白质太多，超出载量，那也是在穿透液中，可以再次过柱，蛋白质不会有任何损失。 4、N端的蛋白测序确实不用设计引物。 5、质谱和测序的问题，我是不建议立即做的，理由就是单条带也可能不纯，因为蛋白质太多，所以存在两个蛋白质跑到一起的隐患。 6、离子交换层析不只是阴离子交换，还有阳离子交换层析的，这就看蛋白质的等电点了。 楼上的猴子路飞怎么把草帽换了，那是梦想，不能换。 |
6楼2011-06-03 15:56:19
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7楼2011-06-05 15:01:28
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8楼2011-06-05 15:10:18
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10楼2011-06-05 19:34:09