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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白纯化分离问题
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tjutrevor

金虫 (正式写手)

[求助] 蛋白纯化分离问题

目前在做酶的分离纯化，报道的仅有4个相同功能的酶，但是比对后基本没有保守序列。。。
我做的菌也没有全基因组序列。。。
是不是只能一步一步纯化，直到SDS一条带？

实验时先过阴离子交换，后过分子筛，但是效果也不好。SDS的杂带较多，但是有一条带貌似是要找的。不知切胶做N端测序可不可以？引物如何设计呢？
还望请大牛们指点。谢谢了
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1楼 2011-06-02 17:41:08
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tjutrevor

金虫 (正式写手)
野生酶。目前只有5个报道，找到的4个基因根本没有同源性。。。。。。。
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3楼2011-06-02 19:23:19
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tjutrevor

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-03 15:56:19:
我不建议第一步就是分子筛，理由是
1、分子量还不知道是多少，因为已经报道的基因没有同源性，不能依靠这个来估计自己的酶的同源性。当然如果能测定酶活力的话也不存在这个问题。
2、粗酶液里杂质较多，如果一下 ...

谢谢您的建议，我下一步试试疏水层析。因为在用阴离子交换的时候，改变了PH，洗脱梯度，发现出峰的范围基本在5-20毫升之间（洗脱体积），不怎么变化。是不是硫氨沉淀后的盐浓度过高导致的？如果是的话，疏水层析就必须做了，呵呵。请您指点，谢谢。
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7楼2011-06-05 15:01:28
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tjutrevor

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-03 15:56:19:
我不建议第一步就是分子筛，理由是
1、分子量还不知道是多少，因为已经报道的基因没有同源性，不能依靠这个来估计自己的酶的同源性。当然如果能测定酶活力的话也不存在这个问题。
2、粗酶液里杂质较多，如果一下 ...

请问疏水层析柱什么牌子的比较好呢？
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8楼2011-06-05 15:10:18
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tjutrevor

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-05 19:36:28:
另外，离子交换层析的细节也可以说一下，包括样品处理，洗脱操作，什么样的pH，离子强度等，有时候细节会造成很大的影响。

离子交换做了pH 7.0,7.5,7.9。洗脱梯度分别作了15%，30%，50%，100%（预配的1.0 M NaCl）。发现洗脱时出峰位置基本不变，5.0mL出峰，基本都在20.0mL出峰结束（出的峰包括杂峰和目标峰）。样品是硫氨沉淀后直接进离子交换，是不是因为样品没除盐，盐浓度过高？
呵呵我们实验室没有这些东西，都是在关系很好的一个老师那里做的实验，但是疏水层析她那里也没有。我可以买了拿到她那里用。 她们那里有FPLC，没注意是什么牌子，不知能否加上疏水层析柱。
谢谢您不啬赐教，非常感谢。您留个邮箱吧，我把离子交换的图给您发一下，请您指点。
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12楼2011-06-05 21:16:33
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tjutrevor

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-05 22:19:25:
你这个酶有没有测定过在穿透液还是那个组分里？各有百分之几？

层析柱的柱床体积多少？

FPLC是可以接层析柱的，但是预装柱购买起来最最起码都要半个月，而且费钱还多，填料稍微便宜一些，就看课题经费怎么承 ...

哈哈 课题经费当然要老板出啊。我只是需要根据实验结果说明疏水层析的重要性即可。也可以到别的组去做一下。图片我上传几张，请你指点吧。
说实话我对生化的东西实在外行，本硕都学化学工程，博士却成了生化。。。还好是环境微生物方向。要是做分子克隆估计没法毕业了，呵呵还望“你”多指点吧。谢谢
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14楼2011-06-05 22:41:40
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tjutrevor

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-05 22:19:25:
你这个酶有没有测定过在穿透液还是那个组分里？各有百分之几？

层析柱的柱床体积多少？

FPLC是可以接层析柱的，但是预装柱购买起来最最起码都要半个月，而且费钱还多，填料稍微便宜一些，就看课题经费怎么承 ...

红箭头是有酶活的部分。很奇怪的是洗脱体积基本都一样。要是疏水层析很有必要，我一定想办法做。老板只要认为有必要，就会帮我想办法，这一点还是很好的，呵呵。
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15楼2011-06-05 22:45:05
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tjutrevor

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-05 23:10:28:
都是5毫升的时候出来蛋白质，是因为柱床体积加上管道体积等于5毫升？

预装柱的还是自己用填料装的柱？

你还没说在各个组分里的酶活力分别占原始酶活力的百分比呢，结合图来看就有有趣的想法了。峰高不等于酶 ...

抱歉没说清楚，我再详细说一下吧。
是连续线性梯度洗脱。0%-30%；0%-15%；0%-50%。
Hitrap Q的预装柱，三个柱子组合在一起。pH7.0，7.5，7.9都试过，过高过低都会对酶活有较大影响。带箭头的峰有酶活（100%），其余的没有。我感到奇怪的是出峰位置为什么基本不变，而且活性峰基本都在同一洗脱体积出来
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17楼2011-06-06 11:01:55
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tjutrevor

金虫 (正式写手)
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Originally posted by tjutrevor at 2011-06-06 11:01:55:
抱歉没说清楚，我再详细说一下吧。
是连续线性梯度洗脱。0%-30%；0%-15%；0%-50%。
Hitrap Q的预装柱，三个柱子组合在一起。pH7.0，7.5，7.9都试过，过高过低都会对酶活有较大影响。带箭头的峰有酶活（100%） ...

突然想起一个问题：设定洗脱梯度的时候，貌似操作过程是：菜单栏里选择pump，...,到达两个选项： gradient设定为 50%，volume设定为75ml。别的没操作。同学说是梯度洗脱，0%-50%，这个设定有没有问题？呵呵 不是很懂，还望指教。
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18楼2011-06-06 11:38:21
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tjutrevor

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-06 18:22:54:
现在只有A280曲线，有没有测定电导率？如果有，就可以马上看出来洗脱梯度实际上是怎样的了，如果没有，就只能靠猜，虽说有点把握，但毕竟是猜。如果有，就跟A280曲线画在一起，弄个双Y轴。等下去做阳离子交换，可 ...

呵呵没存电导率的图， 正好我后天还要去做实验。再确认一下。不过我觉得你的分析很有道理，我打算做疏水层析再看看效果。
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20楼2011-06-06 21:05:57
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