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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 蛋白纯化遇到问题
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majunyang

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化遇到问题

从野生菌里纯化不同蛋白酶组分，发酵液过阴离子柱，穿透峰里检测有酶活，7-56ms/cm电导下也有酶活，流速3ML/min，跑蛋白电泳不能确定是不是同一个组分，又过阳离子柱，还是出现在穿透峰里，洗脱峰居然没有，怎么回事？？？？？？谢谢！！
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1楼2011-12-31 09:58:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

roydxy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+1): 鼓励 2012-01-03 13:19:36
majunyang: 金币+1 2012-03-22 16:21:24
估计流速太快，同样pH的缓冲液阴、阳离子柱都不吸附，说明不是pH值的问题

建议把流速调整到1mL/min或者更慢一些
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10楼2012-01-02 23:17:38
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
不挂柱？看来你还是新手。我这半个月来网速慢不能上这里，今晚能上，但说不定什么时候就又不能上了，不能实时交流，所以你还是搜索所有我回复过的关于蛋白质纯化的帖子，看过之后你就明白了。不过要是你认为我傲慢就算了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
13楼2012-01-05 00:51:47
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★
zhang8826857(金币+5): 鼓励应助 2012-01-06 08:41:19
无论是阴阳离子交换层析柱都要求目的蛋白质的pI与所使用的pH体系相差1个单位，但对于自己从没有纯化过的一个蛋白质来说，pI是未知的，如果用粗酶来测定pI又不够准确。其实没必要测定pI，只要做一个预备实验就可以知道应该使用什么样的pH值缓冲体系：如果有AKTA纯化仪，就使用一根CV=1ml 的层析柱（阴阳层析柱都要做这个预备实验）来吸附蛋白质，收集流穿，然后用1M氯化钠清洗层析柱并收集，这样的两个组分哪个含有你的酶，就知道起码要多少的pH值才能吸附你的酶了。

千万要注意用离子交换层析柱的样品所含盐浓度要低，盐析之后的沉淀含有盐，不能直接用离子交换层析柱来分离，最好是用G25脱盐柱来脱盐，最不济也要透析除盐。

7-56ms/cm是较低的电导，也有酶活说明是pH选择不当，不是样品里含盐多，如果是含盐多，则电导率会高。

在蛋白质能被牢牢吸附的情况下，3ml/min不算高，我使用CV=1ML的层析柱时也使用1ml/min，没问题。

分子筛的先决条件是目的蛋白质与杂质蛋白质分子量相差起码为1倍，但是蛋白酶分子量不会太小，绝大多数蛋白质都处于30-80KD之间，分不开的。
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14楼2012-01-06 08:29:51
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普通回帖

majunyang

银虫 (初入文坛)
注明下，阴离子和阳离子柱都是用的pH7.4缓冲液
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2楼2011-12-31 10:28:14
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
majunyang: 金币+1, ★有帮助 2012-03-22 16:20:54
不知道你的目的蛋白的PH是多少啊，
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3楼2011-12-31 16:44:23
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majunyang

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by lihuan0525 at 2011-12-31 16:44:23:
不知道你的目的蛋白的PH是多少啊，

发酵液经硫酸铵沉淀后的沉淀溶于pH7.4缓冲液，不知等电点是多少
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4楼2011-12-31 20:05:17
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da1234mao

铁虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab(金币+5): 僵尸兄弟，新年快乐！谢谢热心回复哦~~~ 2012-01-01 00:42:33
majunyang: 金币+1 2012-03-22 16:21:06
貌似不保留，建议调下ph值，用阴离子跑哇，个人理解，
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5楼2012-01-01 00:31:47
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majunyang

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by da1234mao at 2012-01-01 00:31:47:
貌似不保留，建议调下ph值，用阴离子跑哇，个人理解，

那换缓冲液还是用原来的磷酸缓冲液吗，另外我纯化酶害怕其他pH下会不稳定。
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6楼2012-01-01 19:08:55
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da1234mao

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by majunyang at 2012-01-01 19:08:55:
那换缓冲液还是用原来的磷酸缓冲液吗，另外我纯化酶害怕其他pH下会不稳定。

最好确定下pH值，如果不行的话，可以选择较为稳妥的分子筛分离，这样应该好些啊。
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7楼2012-01-01 23:35:24
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凡夫俗子

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+1): 鼓励应助 2012-01-03 13:19:16
majunyang: 金币+1 2012-03-22 16:21:13
建议如下：
1. 将硫酸铵盐析得到的蛋白溶于缓冲液；
2. 取等量不同pH缓冲液，分别放入DEAE胶，将1.步骤中经透析后的蛋白加入到DEAE体系，混匀；
3. 测定每个体系中上清液的酶活，测到酶活最低的一组及可以吸附目的蛋白的pH。
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8楼2012-01-02 09:37:30
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dasheng1980

铁杆木虫 (知名作家)

大圣

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+1): 鼓励 2012-01-03 13:19:26
majunyang: 金币+1 2012-03-22 16:21:19
你最好还是测一下等电点，你上离子柱，这还是一个关键的数值，对你的纯化有很大的帮助！
你上阴离子柱柱子上挂了吗？
你上阳离子柱柱上没挂，说明你的缓冲液及样品溶液的PH值高于你样品的等电点！
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dasheng1980
9楼2012-01-02 22:02:21
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