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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 蛋白纯化遇到问题
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majunyang

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化遇到问题

从野生菌里纯化不同蛋白酶组分，发酵液过阴离子柱，穿透峰里检测有酶活，7-56ms/cm电导下也有酶活，流速3ML/min，跑蛋白电泳不能确定是不是同一个组分，又过阳离子柱，还是出现在穿透峰里，洗脱峰居然没有，怎么回事？？？？？？谢谢！！
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1楼 2011-12-31 09:58:50
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
不挂柱？看来你还是新手。我这半个月来网速慢不能上这里，今晚能上，但说不定什么时候就又不能上了，不能实时交流，所以你还是搜索所有我回复过的关于蛋白质纯化的帖子，看过之后你就明白了。不过要是你认为我傲慢就算了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
13楼2012-01-05 00:51:47
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★
zhang8826857(金币+5): 鼓励应助 2012-01-06 08:41:19
无论是阴阳离子交换层析柱都要求目的蛋白质的pI与所使用的pH体系相差1个单位，但对于自己从没有纯化过的一个蛋白质来说，pI是未知的，如果用粗酶来测定pI又不够准确。其实没必要测定pI，只要做一个预备实验就可以知道应该使用什么样的pH值缓冲体系：如果有AKTA纯化仪，就使用一根CV=1ml 的层析柱（阴阳层析柱都要做这个预备实验）来吸附蛋白质，收集流穿，然后用1M氯化钠清洗层析柱并收集，这样的两个组分哪个含有你的酶，就知道起码要多少的pH值才能吸附你的酶了。

千万要注意用离子交换层析柱的样品所含盐浓度要低，盐析之后的沉淀含有盐，不能直接用离子交换层析柱来分离，最好是用G25脱盐柱来脱盐，最不济也要透析除盐。

7-56ms/cm是较低的电导，也有酶活说明是pH选择不当，不是样品里含盐多，如果是含盐多，则电导率会高。

在蛋白质能被牢牢吸附的情况下，3ml/min不算高，我使用CV=1ML的层析柱时也使用1ml/min，没问题。

分子筛的先决条件是目的蛋白质与杂质蛋白质分子量相差起码为1倍，但是蛋白酶分子量不会太小，绝大多数蛋白质都处于30-80KD之间，分不开的。
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14楼2012-01-06 08:29:51
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
我喜欢洗脱20倍柱床体积，洗脱梯度为0-100%，不知道你这个3CV是怎样做的。

同工酶是有可能的
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17楼2012-01-06 09:28:41
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