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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » FPLC蛋白纯化堵柱子？
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] FPLC蛋白纯化堵柱子？

使用FPLC纯化His-tag标记的重组蛋白时，1ml的GE的镍柱总被蛋白粗提液堵住，求解..
上样前处理操作步骤如下，
2L的Ecoli培养物，超声破碎，12,0000g离心1h，0.45um的膜过滤，滤液上HPLC。然后还会堵柱子。已重复两次，哪位大侠可以给个合理解释？
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1楼 2011-10-11 20:49:43
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lhczj

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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lstt09nk(金币+5): 很热心 2011-10-19 12:26:54
楼主遇到的问题基本上是属于原核表达系统的共性问题，具体原因很多，这也跟你的实验中加入物质及加入物质的浓度有关。原核表达破碎后离心可以去除一定的颗粒，但常常放置一段时间后还会有沉淀生成，所以建议在离心后放置于冰箱中使之冷却至后再过滤，这样沉淀会完全些，还有如果这样还不行可以考虑稀释样品，当样品被稀释后就不容易形成沉淀了。还有一种可能是楼主在离心破碎后过滤了一次，然后再调整溶液pH、电导等参数，改变了原来的平衡，使一些杂质析出这都是有可能的。就说这么多吧
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19楼2011-10-17 16:03:59
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普通回帖

quiller2000

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2011-10-11 21:51:18
克隆大虾(金币+2): tks,FPLC是专门用来纯化蛋白的，非HPLC.HPLC我们这一般用来分析或者制备化合物的... 2011-10-12 00:49:09
你这个不是HPLC吧，会不会是你的柱子颗粒太小了，这样给堵了啊！另外，你要看看是不是柱子太长时间不用了，长东西了；还有就是是不是温度太低，而buffer的盐离子浓度太高，有盐出来了，呵呵！
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2楼2011-10-11 21:32:10
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wangds

金虫 (正式写手)
不知道你浓缩了多少体积的蛋白，是不是浓度太高？
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3楼2011-10-11 21:38:39
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
12,0000g离心1h是什么意思？12万倍的超级恐怖离心力！
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4楼2011-10-11 23:39:25
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangds at 2011-10-11 14:38:39:
不知道你浓缩了多少体积的蛋白，是不是浓度太高？

1-2L的培养物，60mlbuffer破碎的...
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5楼2011-10-12 00:50:19
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-10-11 16:39:25:
12,0000g离心1h是什么意思？12万倍的超级恐怖离心力！

呵呵，这个多了个0，谢谢指正...
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6楼2011-10-12 00:51:22
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violet.zhou

木虫 (小有名气)
没有脱盐吧
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7楼2011-10-12 10:02:08
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by violet.zhou at 2011-10-12 03:02:08:
没有脱盐吧

一般纯化结束后，再使用脱盐柱脱盐的...
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8楼2011-10-12 10:14:14
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chu_81

银虫 (小有名气)
太粘了吧！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2011-10-12 10:24:32
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by chu_81 at 2011-10-12 03:24:32:
太粘了吧！
[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

确实是，使用重力柱纯化了下，flowthrough目的蛋白都很多...
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10楼2011-10-13 01:13:59
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enoch_lei

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
克隆大虾(金币+3): 多谢交流 2011-10-13 18:40:08
adslye(金币+2): 鼓励交流~ 2011-10-14 19:41:22
您好！您说的堵柱子是指的是pressure升高了，还是柱子压根就不行了？如果你的蛋白不会precipitate的话（看flowthrough and fraction),那么就是样品太脏了，可以加点streptomycin然后换更高速的离心，稀释一点样品，不会影响你的purification。另外按protocol好好洗一下柱子。
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11楼2011-10-13 04:27:32
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violet.zhou

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2011-10-12 10:14:14:
一般纯化结束后，再使用脱盐柱脱盐的...

先脱盐再纯化
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12楼2011-10-13 09:12:32
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wlt728

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
克隆大虾(金币+5): 多些交流，1L的培养物收集的菌体，50ml的破碎液..蛋白含量确实很高.. 2011-10-13 18:38:57
adslye(金币+2): 鼓励交流~ 2011-10-14 19:41:40
也不用脱盐，不知道你破碎是按怎么个比例，我们一般是菌体：破碎液是1:8.不然蛋白含量太浓样品是很黏的！
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13楼2011-10-13 13:23:05
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by enoch_lei at 2011-10-12 21:27:32:
您好！您说的堵柱子是指的是pressure升高了，还是柱子压根就不行了？如果你的蛋白不会precipitate的话（看flowthrough and fraction),那么就是样品太脏了，可以加点streptomycin然后换更高速的离心，稀释一点样品 ...

pressure到2MPa，柱子原则上应该可以吧，GE的那种1ml His tag 预装柱子.
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14楼2011-10-13 18:39:44
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lihuan0525

金虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
是不是浓度太高了，你可以先稀释一下，看看怎么样
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15楼2011-10-14 09:44:24
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lihuan0525 at 2011-10-14 02:44:24:
是不是浓度太高了，你可以先稀释一下，看看怎么样

放弃了，后来使用重力柱纯化，浓度还可以。
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16楼2011-10-14 15:24:20
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lpw106

银虫 (小有名气)
★
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上hplc柱的样品最好0.2μm过滤  可以保护柱子  也不容易堵
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17楼2011-10-14 16:44:15
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by lpw106 at 2011-10-14 09:44:15:
上hplc柱的样品最好0.2μm过滤  可以保护柱子  也不容易堵

谢谢交流。超声破碎后，12000g离心30min。蛋白上FPLC前，一般使用0.45um的膜过滤。这些操作都比较规范执行了...
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18楼2011-10-15 05:25:47
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by lhczj at 2011-10-17 09:03:59:
楼主遇到的问题基本上是属于原核表达系统的共性问题，具体原因很多，这也跟你的实验中加入物质及加入物质的浓度有关。原核表达破碎后离心可以去除一定的颗粒，但常常放置一段时间后还会有沉淀生成，所以建议在离心 ...

多谢哥们建议。加入就是常规的50mM tris 缓冲液，咪唑浓度20mM. 0.45um膜过滤后，放在4度冰箱，确实有沉淀出来...现在改用重力柱纯化了,效果也还凑合..
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20楼2011-10-19 01:07:02
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cexu2009

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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silicare(金币+11): 处女帖 2011-11-17 12:27:49
请问重力柱在哪里能买到啊？本人实验急用啊，谢谢啦
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21楼2011-11-16 22:44:38
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zhhui1205

铜虫 (小有名气)
蛋白上样量太大了
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22楼2012-05-07 17:29:02
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
23楼2012-05-08 10:36:37
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能是样品的溶解性不好，可以加一些中性的表面活性剂增溶一下目的蛋白质，另外上样液适当稀释。

上样前过滤是必要的，特别注意过滤的温度条件和离心的温度与过柱的条件一样，过滤和离心可是重复多次操作，适当延长时间。
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24楼2015-06-18 17:04:31
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果一定要问蛋白质问什么在低温下和有杂质条件下会沉淀，可能就涉及到蛋白质的折叠和重折叠，以及蛋白子凝聚的问题，就我所知：金属离子和糖肯定能够直接影响蛋白质的折叠，而折叠状态同时就会影响蛋白质的凝聚。
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25楼2015-06-18 17:12:33
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