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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

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[交流] FPLC蛋白纯化堵柱子？

使用FPLC纯化His-tag标记的重组蛋白时，1ml的GE的镍柱总被蛋白粗提液堵住，求解..
上样前处理操作步骤如下，
2L的Ecoli培养物，超声破碎，12,0000g离心1h，0.45um的膜过滤，滤液上HPLC。然后还会堵柱子。已重复两次，哪位大侠可以给个合理解释？

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1楼 2011-10-11 20:49:43

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克隆大虾

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引用回帖:

19楼: Originally posted by lhczj at 2011-10-17 09:03:59:
楼主遇到的问题基本上是属于原核表达系统的共性问题，具体原因很多，这也跟你的实验中加入物质及加入物质的浓度有关。原核表达破碎后离心可以去除一定的颗粒，但常常放置一段时间后还会有沉淀生成，所以建议在离心 ...

多谢哥们建议。加入就是常规的50mM tris 缓冲液，咪唑浓度20mM. 0.45um膜过滤后，放在4度冰箱，确实有沉淀出来...现在改用重力柱纯化了,效果也还凑合..