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vpz2007

木虫 (小有名气)

[求助] His-tag蛋白纯化柱子洗脱液中除去咪唑的办法

请问蛋白溶解在250mM咪唑、50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠中的蛋白洗脱液怎样才能除盐将蛋白改溶解在PBS中呢？
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可以接受失败，但不能失去再次站起来的勇气
1楼 2013-11-08 15:44:27
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
vpz2007: 金币+2, ★有帮助 2013-11-08 19:25:24
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 19:25:56
vpz2007: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-11-09 00:16:48
（1）透析
（2）浓缩样品后上分子筛柱，然后用你想要的溶液洗脱
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2013-11-08 16:27:13
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-08 19:26:02
vpz2007: 金币+1, ★有帮助 2013-11-08 19:28:41
可以试试超滤，比透析快
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3楼2013-11-08 16:30:15
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vpz2007

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2013-11-08 16:27:13
（1）透析
（2）浓缩样品后上分子筛柱，然后用你想要的溶液洗脱

透析的话用什么缓冲液透析呢？透析袋浸泡在哪里？我以前用PBS透析有蛋白在透析袋里面析出，好像是咪唑从透析袋出去之后PH变酸了。分子筛柱的话不是应该大蛋白先出来吗？是除盐啊，怎么换缓冲液呢？
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可以接受失败，但不能失去再次站起来的勇气
4楼2013-11-08 19:25:12
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vpz2007

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpeng227 at 2013-11-08 16:30:15
可以试试超滤，比透析快

请问超滤的话咪唑和其他无机盐都是等体积滤出吗？那最后咪唑浓度也没有降低啊
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可以接受失败，但不能失去再次站起来的勇气
5楼2013-11-08 19:28:16
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by vpz2007 at 2013-11-08 19:25:12
透析的话用什么缓冲液透析呢？透析袋浸泡在哪里？我以前用PBS透析有蛋白在透析袋里面析出，好像是咪唑从透析袋出去之后PH变酸了。分子筛柱的话不是应该大蛋白先出来吗？是除盐啊，怎么换缓冲液呢？...

稳妥的透析是逐步降低咪唑和盐浓度，到你希望的浓度为止

分子筛的小分子(水，盐，有机小分子，这些跟蛋白不是比大小的关系，不是一个数量级的)肯定先跑出来，如果够浓缩的话，换buffer一步到位，而且还可以进一步纯化蛋白
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行至水穷处，坐看云起时
6楼2013-11-08 21:14:37
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vpz2007

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by pennchem at 2013-11-08 21:14:37
稳妥的透析是逐步降低咪唑和盐浓度，到你希望的浓度为止

分子筛的小分子(水，盐，有机小分子，这些跟蛋白不是比大小的关系，不是一个数量级的)肯定先跑出来，如果够浓缩的话，换buffer一步到位，而且还可以进一 ...

透析是说将250mM咪唑、50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠配成的洗脱液逐级降低当做透析袋外面的溶液吗？这样就可以？还是只降低咪唑浓度？

呃，弱弱的问一句，分子筛和除盐小柱一样吗？我们实验室以前有人用Thermo的Zeba脱盐离心柱除盐，那个可以吗，请问有用分子筛更换缓冲液的实验步骤吗？
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可以接受失败，但不能失去再次站起来的勇气
7楼2013-11-09 00:16:00
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wangpeng227

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by vpz2007 at 2013-11-08 19:28:16
请问超滤的话咪唑和其他无机盐都是等体积滤出吗？那最后咪唑浓度也没有降低啊...

可以加上你要换的buffer，几次之后，buffer就被置换了，大分子的蛋白是被截留的，损失也有，但不太大。
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8楼2013-11-09 12:26:18
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by vpz2007 at 2013-11-09 00:16:00
透析是说将250mM咪唑、50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠配成的洗脱液逐级降低当做透析袋外面的溶液吗？这样就可以？还是只降低咪唑浓度？

呃，弱弱的问一句，分子筛和除盐小柱一样吗？我们实验室以前有人用Thermo的 ...

可以使用透析、超滤先除去不要的小分子，再加入需要的小分子，包括新的缓冲溶液，也可以使用分子筛更换缓冲液。

使用使用分子筛更换缓冲液的具体试验方法，请见：
吕宪禹 主编，蛋白质纯化实验方案与应用        ，化学工业出版社，2010,39-41，全书下载：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6307126&fpage=1&target=blank
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9楼2014-07-17 00:03:17
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