应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白质纯化中硫酸铵沉淀后沉淀溶解的问题
121/2返回列表12下一页
查看: 6418  |  回复: 11
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

mufeinic

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质纯化中硫酸铵沉淀后沉淀溶解的问题

本人在做天然蛋白质的纯化。第一步采用硫酸铵分级沉淀。30%饱和硫酸铵沉淀中确定有目的蛋白。问题一：我打算过根离子交换柱，要用柠檬酸盐缓冲液溶解沉淀，但是缓冲液无法将沉淀完全溶解，我将不溶的蛋白离心去除，上清用来上样，但是很快又会出沉淀。有什么解决办法？问题二：考虑到可能是盐没有除干净，我打算把离子柱换成疏水柱，就用1M硫酸铵来溶解沉淀，但是仍然无法完全溶解。我想是不是1M硫酸铵加进去，会使一部分蛋白再次沉淀，所以无法溶解。但是如果硫酸铵浓度再低的话，就会挂不上柱子。教科书说硫酸铵沉淀后适合上疏水柱，但是我实际操作并不是这样，为什么?我用的辛基疏水柱。还有，我暂时不考虑透析和超滤方法。
谢谢。第一次发贴，希望有经验的高手帮助。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2013-07-17 00:13:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-21 08:10:10
我不懂除去盐如果不用超滤和透析，也该用分子筛层析呀，为何要直接上疏水层析？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-07-17 00:19:50
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-21 08:10:04
从蛋白质之折叠角度，用分子筛层析把盐去掉以分子量分离后加入盐，蛋白质也可以恢复到初始构象。

但是我很怀疑：细胞生理条件下能够有1M硫酸铵PH是7.0   这个范围内的等同大小离子强度的微环境，古生菌可能除外。

硫酸铵沉淀后适合上疏水柱，洗脱是用疏水试剂与靠疏水相互作用结合到疏水柱上的蛋白质分子表面的疏水基团竞争疏水柱的疏水结合基团，硫酸铵在洗脱液中对于疏水试剂和蛋白质分子表面的疏水基团的作用都是同方向的。
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2013-07-17 22:48:59
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

zhangyi05

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 11:57:53
本帖内容被屏蔽
3楼2013-07-17 10:01:18
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mufeinic

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-17 00:19:50
我不懂除去盐如果不用超滤和透析，也该用分子筛层析呀，为何要直接上疏水层析？

试验条件限制除盐柱不能用。上疏水柱最初是为了不用除盐
赞一下 回复此楼
4楼2013-07-17 10:54:58
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mufeinic

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangyi05 at 2013-07-17 10:01:18
疏水层析不需要除盐，离子层析才需要除盐。不过疏水层析没哟操作过，帮不了你。
楼主看看溶液的PH值是不是合适？

柠檬酸盐溶液PH是 4.5, 1M硫酸铵PH是7.0   这个范围内可以保证我的目的蛋白没问题，但是其他杂蛋白就不知道了。  这两个溶液都是柱子的平衡液，所以PH可改变的空间不大。
赞一下 回复此楼
5楼2013-07-17 10:58:30
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-21 08:10:17
疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱。
硫酸铵是在溶液中解离成为离子，带有电荷，所以极性强，使得蛋白质的疏水表面与疏水作用层析柱的疏水基团紧密结合到一起，从溶液中被提取出去。
赞一下 回复此楼
6楼2013-07-17 22:37:28
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-21 08:10:24
引用回帖:
5楼: Originally posted by mufeinic at 2013-07-17 10:58:30
柠檬酸盐溶液PH是 4.5, 1M硫酸铵PH是7.0   这个范围内可以保证我的目的蛋白没问题，但是其他杂蛋白就不知道了。  这两个溶液都是柱子的平衡液，所以PH可改变的空间不大。...

我很怀疑细胞生理条件下能够达到与1M硫酸铵的离子强度相同的离子强度环境，大概古生菌细胞可以到如此高的离子强度，即便如此用分子筛层析先去掉盐而分离，而后再把盐加回去蛋白质恢复天然构象也不难（如果在1M硫酸铵PH是7.0的目地蛋白质的构象是天然构象的话）。
赞一下 回复此楼
7楼2013-07-17 22:41:55
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mufeinic

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-17 22:48:59
从蛋白质之折叠角度，用分子筛层析把盐去掉以分子量分离后加入盐，蛋白质也可以恢复到初始构象。

但是我很怀疑：细胞生理条件下能够有1M硫酸铵PH是7.0   这个范围内的等同大小离子强度的微环境，古生菌可能除外。 ...

最近硫酸铵沉淀后再溶解时我发现了一个现象：PH8.0的磷酸钠缓冲液比PH4.5的柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀溶解的更好。 我猜测是PH低的原因导致部分蛋白变性。但是，我做的是昆虫的血淋吧，血淋吧最初就是用PH4.5的柠檬酸钠缓冲液溶解的，为什么那时蛋白很稳定呢
赞一下 回复此楼
9楼2013-07-18 10:48:18
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-21 08:10:30
确定蛋白质是否是天然构想，最简单的办法就是对比目的蛋白质与天然蛋白质的标准品的红外傅里叶光谱和紫外光谱两个值是不是一样。
赞一下 回复此楼
10楼2013-07-18 11:32:56
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 mufeinic 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭