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蛋白质纯化中硫酸铵沉淀后沉淀溶解的问题
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本人在做天然蛋白质的纯化。第一步采用硫酸铵分级沉淀。30%饱和硫酸铵沉淀中确定有目的蛋白。问题一：我打算过根离子交换柱，要用柠檬酸盐缓冲液溶解沉淀，但是缓冲液无法将沉淀完全溶解，我将不溶的蛋白离心去除，上清用来上样，但是很快又会出沉淀。有什么解决办法？问题二：考虑到可能是盐没有除干净，我打算把离子柱换成疏水柱，就用1M硫酸铵来溶解沉淀，但是仍然无法完全溶解。我想是不是1M硫酸铵加进去，会使一部分蛋白再次沉淀，所以无法溶解。但是如果硫酸铵浓度再低的话，就会挂不上柱子。教科书说硫酸铵沉淀后适合上疏水柱，但是我实际操作并不是这样，为什么?我用的辛基疏水柱。还有，我暂时不考虑透析和超滤方法。 谢谢。第一次发贴，希望有经验的高手帮助。 |
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-21 08:10:17
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疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。 溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱。 硫酸铵是在溶液中解离成为离子，带有电荷，所以极性强，使得蛋白质的疏水表面与疏水作用层析柱的疏水基团紧密结合到一起，从溶液中被提取出去。 |
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