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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白质的Ni柱纯化问题
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本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看

yaokuaile

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质的Ni柱纯化问题

本人在做一个蛋白的Ni柱纯化，第一次的蛋白表达N端His，过Ni柱，因为不挂柱，所以进行了双His表达，但是，再次过Ni柱时情况很诡异，不同的咪唑梯度都能洗脱下来N多条带。用此Ni柱过其他蛋白时，也是可以洗脱掉N多条带，因此，想请教各位，请各位大虾帮帮忙啊，这种情况该怎么处理啊？！谢过了啊

20121106 Ni柱结果.jpg
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1楼 2012-11-06 10:59:43
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回帖置顶 ( 共有1个 )

foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 正解 2012-11-06 11:32:18
不挂柱不一定是His标签的问题，buffer的ph也会影响挂柱；另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧，你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了
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　　　　　　　　　♨物是人非事事休，欲语泪先流♨
3楼2012-11-06 11:24:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

加内特

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我做过很多次镍柱纯化，不下30次。我觉得
1.你这个是新柱子吗？新柱子结合力强，杂带多。
2.你的buffer是按照说明书上配的吗？GE预装柱的buffer是ph7.4的PB，加0.5mol/l的Nacl，离子浓度高，减少非特异性结合。一切按照说明书来！
3.也可能是你梯度设的太少，没把杂蛋白洗下来。我一般都是50一个梯度，从50洗到500.
我用GE的预装柱，梯度设多一些，洗出来的都很纯，我纯化过4个蛋白，都是加组氨酸标签镍柱纯化的
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少壮不努力，老大徒伤悲！
8楼2012-11-07 08:56:54
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你没说明各泳道是什么样品，不好分析。
一般来说，样品上柱前用不含样品的缓冲液洗柱子减少非特异性吸附。杂带多可能是样品上柱后洗涤不够，增加洗涤时间和体积。把上柱前、flow through, wash, elute都留样跑胶。
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2楼2012-11-06 11:24:11
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by foryever at 2012-11-06 11:24:51
不挂柱不一定是His标签的问题，buffer的ph也会影响挂柱；另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧，你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了

首先，非常感谢您的热情回复。
目的蛋白的pI是4.06，我用的buffer pH为7.0.
用不同的咪唑梯度是可以洗下各种蛋白，但是，没有一个浓度是可以洗下单一的条带的，所以不解。。。
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4楼2012-11-06 12:06:36
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)
★
yqbter: 金币+1, 鼓励新虫发帖！ 2012-11-06 17:12:08
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-06 11:24:11
你没说明各泳道是什么样品，不好分析。
一般来说，样品上柱前用不含样品的缓冲液洗柱子减少非特异性吸附。杂带多可能是样品上柱后洗涤不够，增加洗涤时间和体积。把上柱前、flow through, wash, elute都留样跑胶。

首先，感谢您的回复。
样品顺序是：上清，流穿，buffer洗脱液，20，50,100,250,500,1000mM咪唑洗脱液，最后为沉淀。
对啊，我在上柱之前用20ml的buffer洗的，之后上样，过两次，所有样品都跑了SDS-PAGE。
怪异的是，我之前做的另一个蛋白，是可以用250mM咪唑洗脱下单一目的条带的，但是，前一次又过Ni柱，发现250mM洗下了好多条带。不解。。。
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5楼2012-11-06 12:12:00
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)
请大家多多帮忙啊
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6楼2012-11-06 18:40:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你的目的蛋白分子量是多少？marker各条带的分子量说明一下。问一下洗涤的时候你洗了多少个柱身体积？你的20mM咪唑洗就可以看到明显的蛋白下来。你的样品和上柱缓冲液是否含有低浓度咪唑？一般可以用~10mM的咪唑可以降低非特异性结合。
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7楼2012-11-07 07:34:39
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-07 07:34:39
你的目的蛋白分子量是多少？marker各条带的分子量说明一下。问一下洗涤的时候你洗了多少个柱身体积？你的20mM咪唑洗就可以看到明显的蛋白下来。你的样品和上柱缓冲液是否含有低浓度咪唑？一般可以用~10mM的咪唑可以 ...

O(∩_∩)O谢谢。
目的蛋白分子量为21.9kD，marker分子量分别为97,66,44,29,20.4和14kD。我用了两个柱体积洗的，样品和buffer都没有加咪唑呢。
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9楼2012-11-07 09:06:31
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 加内特 at 2012-11-07 08:56:54
我做过很多次镍柱纯化，不下30次。我觉得
1.你这个是新柱子吗？新柱子结合力强，杂带多。
2.你的buffer是按照说明书上配的吗？GE预装柱的buffer是ph7.4的PB，加0.5mol/l的Nacl，离子浓度高，减少非特异性结合。一 ...

1.不算是新柱子了，我也用它过过另一个蛋白。用的也有十多次了
2.buffer不是按说明书配的，我要纯化这个蛋白做酶活
3.我设了六个梯度，从20到1000
O(∩_∩)O谢谢！~
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10楼2012-11-07 09:08:51
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