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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 纯化时蛋白一上柱就絮凝
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

[求助] 纯化时蛋白一上柱就絮凝

恼死了，用大肠杆菌表达系统表达了一蛋白，可溶，在上清中。可是纯化时，将蛋白一加到Ni2+柱中，马上就絮凝了，与填料一起结合成团状的东西。
起初蛋白浓度挺高，在4℃下和-20℃下过夜都会絮凝起来，后来将蛋白溶液稀释了5-8倍，保存时不会出现絮凝了，可是一上柱又出现了絮凝，真是搞不懂了！
请大侠们给我分析分析，究竟怎么回事？能不能再给我提点建议什么的，谢谢啦！
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1楼 2013-05-23 19:13:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aofeng860308(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:14:48
aofeng860308: 金币+1, ★有帮助, OK，Let me try，Thank you。 2013-05-24 10:25:18
try to add more NaCl salt into the buffer, load less sample to the column. Furthermore, adjust your PH to see if under different PH can maximize the protein's dissolvability.
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immunologyparasite
2楼2013-05-24 00:30:51
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
aofeng860308: 金币+1, ★有帮助 2013-05-24 10:25:30
1 可以加入0.5M nacl试试
2 看一下你的氨基酸组成，是否有独立的半胱氨酸，有的话要加dtt 的。否则就都氧化聚集而沉淀了。
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3楼2013-05-24 08:22:45
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-24 08:22:45
1 可以加入0.5M nacl试试
2 看一下你的氨基酸组成，是否有独立的半胱氨酸，有的话要加dtt 的。否则就都氧化聚集而沉淀了。

我的样品中是加有0.5M的NaCl的。这个蛋白的半胱氨酸确实较多，由于大多填料都不耐DTT，所以选择加了15mM的β-ME，可是还是有这个问题。
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4楼2013-05-24 10:18:36
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也遇见过类似情况，但貌似不影响纯化...
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5楼2013-05-24 10:28:10
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by aofeng860308 at 2013-05-24 10:18:36
我的样品中是加有0.5M的NaCl的。这个蛋白的半胱氨酸确实较多，由于大多填料都不耐DTT，所以选择加了15mM的β-ME，可是还是有这个问题。...

那絮凝在柱子上 可以用500mm imi 洗下来吗 能的话  你接收的时候，要立刻稀释，可能你的蛋白就是不耐高浓度。也可以加10%甘油试试，或者更多。
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6楼2013-05-24 10:36:37
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最近我碰到了类似情况。

我的蛋白质含多个半胱氨酸，过Ni柱时沉淀，需要加TCEP稳定蛋白质。可以试试《5mM TCEP。

要么改成GST标记，用GST柱分离，效果会更好，而且不用担心还原剂的使用。
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9楼2013-05-24 11:02:05
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
aofeng860308: 金币+1, ★有帮助 2013-05-24 12:21:32
我做的时候没什么影响，因为蛋白表达量比较大，所以没当回事，上样结束之后，顶上有一小段柱材料变白了，之后用漂洗液冲洗杂蛋白就没有了，最后洗脱目标蛋白也没见到有什么影响.....
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10楼2013-05-24 11:03:14
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普通回帖

aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-24 10:36:37
那絮凝在柱子上 可以用500mm imi 洗下来吗 能的话  你接收的时候，要立刻稀释，可能你的蛋白就是不耐高浓度。也可以加10%甘油试试，或者更多。...

看到这种现象就没往下做了，还不知道能不能洗下来呢。我的裂解液中也加10%的甘油了的。
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7楼2013-05-24 10:56:15
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by whb21 at 2013-05-24 10:28:10
我也遇见过类似情况，但貌似不影响纯化...

这个不影响纯化吗？我看到这现象就没往下做了！
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8楼2013-05-24 10:56:57
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