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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 纯化时蛋白一上柱就絮凝
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by mitocam at 2013-05-24 11:02:05
最近我碰到了类似情况。

我的蛋白质含多个半胱氨酸，过Ni柱时沉淀，需要加TCEP稳定蛋白质。可以试试《5mM TCEP。

要么改成GST标记，用GST柱分离，效果会更好，而且不用担心还原剂的使用。

请教一下，这个TCEP和β-ME有多大区别？我现在加了15mM的β-ME存在这个问题，改加5mM的TCEP能解决这个问题的几率有多大呢？
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11楼2013-05-24 11:13:31
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
aofeng860308: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-24 12:12:25
TCEP还原能力更强，更稳定，而且不受金属离子催化氧化的影响，因为DTT或ME在有金属离子（如NI柱上的镍离子）存在的情况下，会很快被氧化失效的。

TCEP是否解决问题，决定于你蛋白质絮凝的根源，如果单单因为还原力不够的原因，TCEP可能能够解决问题。如果你的蛋白还有因为不能正确折叠而产生不稳定结构，你还得解决折叠问题。简单判断，你如果洗脱NI柱上得絮凝蛋白质，是否含有大量75kDa的蛋白质，如果有，就可能时HSP70，由于蛋白质不能正确折叠，所以伴侣蛋白不能释放出来。
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12楼2013-05-24 11:33:50
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by mitocam at 2013-05-24 11:33:50
TCEP还原能力更强，更稳定，而且不受金属离子催化氧化的影响，因为DTT或ME在有金属离子（如NI柱上的镍离子）存在的情况下，会很快被氧化失效的。

TCEP是否解决问题，决定于你蛋白质絮凝的根源，如果单单因为还原 ...

非常感谢。从电泳上看，HSP70应该不存在。或许是我的ME被氧化失效了， 我加了后在4℃下放了一段时间，现在都不怎么能闻到ME的那恶心的臭味了。再次感谢！
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13楼2013-05-24 12:18:24
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by whb21 at 2013-05-24 11:03:14
我做的时候没什么影响，因为蛋白表达量比较大，所以没当回事，上样结束之后，顶上有一小段柱材料变白了，之后用漂洗液冲洗杂蛋白就没有了，最后洗脱目标蛋白也没见到有什么影响.....

我用的是离心法，一加样，混合一下，整个都成团状了！
我往下做做看，要是不影响就好了。谢谢！
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14楼2013-05-24 12:21:16
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by aofeng860308 at 2013-05-24 10:56:15
看到这种现象就没往下做了，还不知道能不能洗下来呢。我的裂解液中也加10%的甘油了的。...

我们纯化蛋白的时候，上清表达比较多的话，以上镍柱柱子就会变白的，用咪唑洗脱的时候还会有洗脱环出现，但是洗下来的是可溶的。
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15楼2013-05-24 15:01:18
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千纯生物

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by aofeng860308 at 2013-05-24 10:18:36
我的样品中是加有0.5M的NaCl的。这个蛋白的半胱氨酸确实较多，由于大多填料都不耐DTT，所以选择加了15mM的β-ME，可是还是有这个问题。...

可以用超耐受的Ni-TED柱子
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16楼2019-05-13 11:20:38
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