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aofeng860308木虫 (正式写手)
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[求助]
纯化时蛋白一上柱就絮凝
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恼死了，用大肠杆菌表达系统表达了一蛋白，可溶，在上清中。可是纯化时，将蛋白一加到Ni2+柱中，马上就絮凝了，与填料一起结合成团状的东西。 起初蛋白浓度挺高，在4℃下和-20℃下过夜都会絮凝起来，后来将蛋白溶液稀释了5-8倍，保存时不会出现絮凝了，可是一上柱又出现了絮凝，真是搞不懂了！ 请大侠们给我分析分析，究竟怎么回事？能不能再给我提点建议什么的，谢谢啦！ |
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mitocam
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
aofeng860308: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-24 12:12:25
aofeng860308: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-24 12:12:25
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TCEP还原能力更强，更稳定，而且不受金属离子催化氧化的影响，因为DTT或ME在有金属离子（如NI柱上的镍离子）存在的情况下，会很快被氧化失效的。 TCEP是否解决问题，决定于你蛋白质絮凝的根源，如果单单因为还原力不够的原因，TCEP可能能够解决问题。如果你的蛋白还有因为不能正确折叠而产生不稳定结构，你还得解决折叠问题。简单判断，你如果洗脱NI柱上得絮凝蛋白质，是否含有大量75kDa的蛋白质，如果有，就可能时HSP70，由于蛋白质不能正确折叠，所以伴侣蛋白不能释放出来。 |
12楼2013-05-24 11:33:50
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aofeng860308(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:14:48
aofeng860308: 金币+1, ★有帮助, OK，Let me try，Thank you。 2013-05-24 10:25:18
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aofeng860308(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:14:48
aofeng860308: 金币+1, ★有帮助, OK，Let me try，Thank you。 2013-05-24 10:25:18
| try to add more NaCl salt into the buffer, load less sample to the column. Furthermore, adjust your PH to see if under different PH can maximize the protein's dissolvability. |
2楼2013-05-24 00:30:51
3楼2013-05-24 08:22:45
aofeng860308
木虫 (正式写手)
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4楼2013-05-24 10:18:36