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aofeng860308

木虫 (正式写手)

[求助] 纯化时蛋白一上柱就絮凝

恼死了,用大肠杆菌表达系统表达了一蛋白,可溶,在上清中。可是纯化时,将蛋白一加到Ni2+柱中,马上就絮凝了,与填料一起结合成团状的东西。
起初蛋白浓度挺高,在4℃下和-20℃下过夜都会絮凝起来,后来将蛋白溶液稀释了5-8倍,保存时不会出现絮凝了,可是一上柱又出现了絮凝,真是搞不懂了!
请大侠们给我分析分析,究竟怎么回事?能不能再给我提点建议什么的,谢谢啦!
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robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
aofeng860308(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-24 03:14:48
aofeng860308: 金币+1, 有帮助, OK,Let me try,Thank you。 2013-05-24 10:25:18
try to add more NaCl salt into the buffer, load less sample to the column. Furthermore, adjust your PH to see if under different PH can maximize the protein's dissolvability.
immunologyparasite
2楼2013-05-24 00:30:51
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
aofeng860308: 金币+1, 有帮助 2013-05-24 10:25:30
1 可以加入0.5M nacl试试
2 看一下你的氨基酸组成,是否有独立的半胱氨酸,有的话要加dtt 的。否则就都氧化聚集而沉淀了。
3楼2013-05-24 08:22:45
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-24 08:22:45
1 可以加入0.5M nacl试试
2 看一下你的氨基酸组成,是否有独立的半胱氨酸,有的话要加dtt 的。否则就都氧化聚集而沉淀了。

我的样品中是加有0.5M的NaCl的。这个蛋白的半胱氨酸确实较多,由于大多填料都不耐DTT,所以选择加了15mM的β-ME,可是还是有这个问题。
4楼2013-05-24 10:18:36
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我也遇见过类似情况,但貌似不影响纯化...
5楼2013-05-24 10:28:10
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by aofeng860308 at 2013-05-24 10:18:36
我的样品中是加有0.5M的NaCl的。这个蛋白的半胱氨酸确实较多,由于大多填料都不耐DTT,所以选择加了15mM的β-ME,可是还是有这个问题。...

那絮凝在柱子上 可以用500mm imi 洗下来吗 能的话  你接收的时候,要立刻稀释,可能你的蛋白就是不耐高浓度。也可以加10%甘油试试,或者更多。
6楼2013-05-24 10:36:37
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
最近我碰到了类似情况。

我的蛋白质含多个半胱氨酸,过Ni柱时沉淀,需要加TCEP稳定蛋白质。可以试试《5mM TCEP。

要么改成GST标记,用GST柱分离,效果会更好,而且不用担心还原剂的使用。
9楼2013-05-24 11:02:05
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


aofeng860308: 金币+1, 有帮助 2013-05-24 12:21:32
我做的时候没什么影响,因为蛋白表达量比较大,所以没当回事,上样结束之后,顶上有一小段柱材料变白了,之后用漂洗液冲洗杂蛋白就没有了,最后洗脱目标蛋白也没见到有什么影响.....
10楼2013-05-24 11:03:14
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普通回帖

aofeng860308

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-24 10:36:37
那絮凝在柱子上 可以用500mm imi 洗下来吗 能的话  你接收的时候,要立刻稀释,可能你的蛋白就是不耐高浓度。也可以加10%甘油试试,或者更多。...

看到这种现象就没往下做了,还不知道能不能洗下来呢。我的裂解液中也加10%的甘油了的。
7楼2013-05-24 10:56:15
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by whb21 at 2013-05-24 10:28:10
我也遇见过类似情况,但貌似不影响纯化...

这个不影响纯化吗?我看到这现象就没往下做了!
8楼2013-05-24 10:56:57
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