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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于镍柱纯化蛋白
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

[求助] 关于镍柱纯化蛋白

我蛋白样品挂镍柱后，，用含200mM米错液洗脱，这样米错不是挂在镍柱上了吗，下次使用时。我的样品怎么还能在挂上去？
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sweetcrystal

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1楼 2012-05-25 12:53:42
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回帖置顶 ( 共有1个 )

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！ 2012-05-25 17:33:19
viki_MDK: 金币+5 2012-05-25 18:06:28
这就是涉及到柱子再生平衡的问题了。
你可以直接用纯水冲洗5-10个柱体积就行了。咪唑就冲下来了。要是长久不用的再换上20%的乙醇保存就行了。
楼上说的都是重新挂ni的方法，其实只要在柱子载量不降低的情况下没必要重复挂柱。毕竟重复挂柱还是没有原装的好的。
给你篇GE参考文献看看。
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  • 附件 1 : Ni柱使用.pdf
    • 2012-05-25 17:21:57, 352.6 K
  • 附件 2 : HisTrap-FF.pdf
    • 2012-05-25 17:22:05, 98.27 K
6楼2012-05-25 17:22:48
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普通回帖

lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-25 19:07:43
把柱子再生一下就是了，亲和的我没有做过，但是离子交换的，在做完以后，都要用NAOH溶液冲洗，你看看说明吧
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2楼2012-05-25 13:45:32
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kedaxiaoyu

木虫 (职业作家)

神虫浮云

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励 2012-05-25 19:07:50
（咪唑在215nm有较高的吸收）咪唑洗脱完后用水冲，开始在215nm的吸收会很高的，用水多冲会，紫外吸收会降下，说明咪唑冲干净了。
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3楼2012-05-25 13:57:53
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kedaxiaoyu

木虫 (职业作家)

神虫浮云

【答案】应助回帖

用咪唑洗脱的Ni柱是可重复使用几次之后再重新挂Ni再生的。
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4楼2012-05-25 14:03:56
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-05-25 19:08:04
目标蛋白洗脱下来后，柱子需要再生：
再生步骤
1，10倍stripping buffer(洗除残留的NI)
2，10倍的binding
3,10倍的水
4，10倍0.1M的硫酸镍
5，10倍水
6,10倍binding buffer
7,10倍水
20%的乙醇保存（10倍）
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nothing isimpossible
5楼2012-05-25 14:12:14
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pengyun2521

木虫 (正式写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-27 21:52:53
用完之后可以加BuffreA（0mM咪唑）保存，下次用之前再活化.

活化原理：使用EDTA (100mM)与镍结合，用大量的水将其洗脱；然后再次挂上新的镍，使其能于与所用的蛋白结合，最后又不同浓度的咪唑所需蛋白洗脱即可！
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不积跬步无以至千里！
7楼2012-05-27 17:59:34
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sweetcrystal

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
thank you
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8楼2012-07-03 11:20:09
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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars
引用回帖:
6楼: Originally posted by dshlove at 2012-05-25 17:22:48
这就是涉及到柱子再生平衡的问题了。
你可以直接用纯水冲洗5-10个柱体积就行了。咪唑就冲下来了。要是长久不用的再换上20%的乙醇保存就行了。
楼上说的都是重新挂ni的方法，其实只要在柱子载量不降低的情况下没必 ...

结合这么不牢固吗，按说洗脱蛋白的咪唑与NI柱的结合能力还要强与目的蛋白，哪结合的目的蛋白为什么直接用水洗脱不下来
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笑对人生，相信自己。
9楼2013-01-07 15:16:04
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by grape114 at 2013-01-07 15:16:04
结合这么不牢固吗，按说洗脱蛋白的咪唑与NI柱的结合能力还要强与目的蛋白，哪结合的目的蛋白为什么直接用水洗脱不下来...

结合的机理不同。
咪唑能洗下蛋白，水能洗下咪唑，但是水洗不下来蛋白，当然不是绝对的，不知道你有没有遇到一种蛋白，洗脱时候是看水的纯度的，水的纯度越高洗脱越好。
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10楼2013-01-07 15:30:12
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