应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性
251/1返回列表
查看: 4339  |  回复: 24
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Shinning123

新虫 (初入文坛)

[交流] β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性

最近表达几个β-糖苷酶基因（pet载体，BL21DE3），目的基因可溶性蛋白很多，也经过镍柱纯化了，蛋白电泳也跑了，都没什么问题，但就是在用pNP-G测活性时，都没活性，包括裂解全菌液，上清，纯化后的蛋白。酶活测定的条件是：醋酸钠缓冲液（ph 4, 4.5,  5,  7.0都试了）50ul+400ul水+15ulpNP-G +酶液。37度水浴几个小时也没反应。 大家指点下吧，是哪里有问题，谢谢了
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

生工检测理论与实务

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-12-04 13:45:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

Shinning123

新虫 (初入文坛)
Shinning123: 回帖置顶 2011-12-05 21:15:09
谢谢各位的建议，问题已经解决了
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

FPshuicao
12楼2011-12-05 21:15:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-12-04 18:54:06
Shinning123(金币+5): 2011-12-04 22:54:19
pNPG是邻（对）-硝基苯酚葡萄糖苷，被β-葡萄糖苷酶水解后生产pNP,
pNP在碱性条件下才显黄色！！ 显色之后才可以测吸光值，换算成酶活。
我以前就是做纤维素酶的，β-葡萄糖苷酶最适温度通常是40-50度，有的更高。另外 脂肪酶和这个有关么？无关吧！
关于表达，你可以尝试低温过夜表达，然后超声破碎沉淀，包涵体可以用尿素复活。详细的自己查资料了。
赞一下(4人) 回复此楼
7楼2011-12-04 18:31:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-12-04 14:55:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Shinning123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 14:55:57:
原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了

它没活性应该就是包涵体表达吧，那怎么会都是可溶性的蛋白呢，我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题？
赞一下 回复此楼
3楼2011-12-04 16:18:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-04 16:18:17:
它没活性应该就是包涵体表达吧，那怎么会都是可溶性的蛋白呢，我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题？

1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记得是最后用碳酸钠或氢氧化钠等碱性物质终止反应
在碱性条件下pNP才显黄色
4. 你的酶英文名叫什么？beta-glucosidase?最适反映温度应该是40度以上

[ Last edited by MaoNaiJi on 2011-12-4 at 17:26 ]
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-12-04 17:24:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Shinning123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 17:24:27:
1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记 ...

是beta-glucosidase，我的反应温度在37，应该差不多吧，pNP-G不用在碱性下才显示吧，它是被水解后产生的pNP才显黄色的呀，我以前做脂肪酶的也是这样反应就行了，没有碱性终止。只不过我在纯化和透析过程中用的是ph8的Tris-Hcl缓冲液，还有这个酶先有人也是这样表达出来有活性的，到我这表达就酶活性了
赞一下 回复此楼
6楼2011-12-04 18:02:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+4): 专家就是不一样啊…… 2011-12-04 21:22:13
Shinning123(金币+2): 2011-12-04 23:02:03
引用回帖:
1楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-04 13:45:44:
最近表达几个β-糖苷酶基因（pet载体，BL21DE3），目的基因可溶性蛋白很多，也经过镍柱纯化了，蛋白电泳也跑了，都没什么问题，但就是在用pNP-G测活性时，都没活性，包括裂解全菌液，上清，纯化后的蛋白。酶活测定 ...

纤维二糖水解酶？为何不先用含七叶苷的平板检测有没有活性？既然没有活性，为什么还纯化？没有活性的东西，纯化之后也是没有活性的。如果表达重组菌株在平板培养过程中不能使菌落及菌落附近变黑，那就是有问题，你的重组质粒转化之后有没有用平板筛选阳性转化子，不会是转化之后就直接液体培养，然后吭哧吭哧的纯化去了？

测定酶活性的温度没有问题，05年我做过宏基因组文库，大肠杆菌培养和平板显色我都是用37度的，我筛选得到多个阳性克隆了。关于表达，我没有做这个酶，只是做了5个其它的纤维素酶基因，我觉得BL21(DE3)是没问题的，我唯一怀疑的就是基因在PCR的过程中突变了，可能是点突变，移码基本上不可能。
赞一下(2人) 回复此楼
8楼2011-12-04 21:11:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Shinning123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-04 21:11:52:
纤维二糖水解酶？为何不先用含七叶苷的平板检测有没有活性？既然没有活性，为什么还纯化？没有活性的东西，纯化之后也是没有活性的。如果表达重组菌株在平板培养过程中不能使菌落及菌落附近变黑，那就是有问题， ...

谢谢你的回复，七叶苷的筛选方法我之前也做过。这个酶我是接手过来的，老板说先前表达是有活性的，但我和我师弟两个人都做了，还是没酶活。谢谢你的建议，我们准备七叶苷平板试试，再确认下
赞一下 回复此楼
9楼2011-12-04 23:01:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
先确认重组菌株的情况再做，导师的话不一定全对，因为之前的人可能为了毕业做了手脚。万事谨慎，不然会费冤枉事。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2011-12-04 23:43:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wanglei512

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
用buffer将菌体细胞重悬后，高浓度溶菌酶处理30min-1h
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2011-12-05 19:23:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
13楼2012-04-15 21:40:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
14楼2012-04-15 21:42:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
15楼2012-04-15 21:46:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

肖-洋

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-04 21:11:52
纤维二糖水解酶？为何不先用含七叶苷的平板检测有没有活性？既然没有活性，为什么还纯化？没有活性的东西，纯化之后也是没有活性的。如果表达重组菌株在平板培养过程中不能使菌落及菌落附近变黑，那就是有问题，你 ...

我用七叶苷培养基上滴上纯的β-D-葡萄糖苷酶酶液，都没有出现培养基变黑的现象，这是怎么回事呢，想请教一下，谢谢
赞一下 回复此楼
16楼2013-03-22 16:26:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

肖-洋

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-04 23:01:45
谢谢你的回复，七叶苷的筛选方法我之前也做过。这个酶我是接手过来的，老板说先前表达是有活性的，但我和我师弟两个人都做了，还是没酶活。谢谢你的建议，我们准备七叶苷平板试试，再确认下...

我用七叶苷培养基上滴上纯的β-D-葡萄糖苷酶酶液，都没有出现培养基变黑的现象，这是怎么回事呢，想请教一下，谢谢
赞一下 回复此楼
17楼2013-03-22 16:26:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by 肖-洋 at 2013-03-22 16:26:35
我用七叶苷培养基上滴上纯的β-D-葡萄糖苷酶酶液，都没有出现培养基变黑的现象，这是怎么回事呢，想请教一下，谢谢...

http://www.cnki.net/kcms/detail/ ... jgrb1FMQUhxeGgwPQ==

封毅.jpg
赞一下 回复此楼
18楼2013-03-22 22:52:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

肖-洋

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-03-22 22:52:38
http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&QueryID=0&CurRec=2&dbname=CDFD0911&filename=2007142568.nh&uid=WEEvREcwSlJHSldRa1FhdlZYL0tUZTU1ZUhxMm5UbFdGMGVTV1phOVhMdUwy ...

我的培养基含有0.1%七叶苷，0.03%的Fecl3，0.67%的YNB，然后滴上来自于苦杏仁中的纯的β-D-葡萄糖苷酶的纯酶液，就是观察不到培养基上出现黑色晕圈的现象，想请问一下原因？谢谢
赞一下 回复此楼
19楼2013-03-28 21:10:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Hannet

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-05 21:15:02
谢谢各位的建议，问题已经解决了

楼主，我也遇到同样的问题，问题是怎么解决呢？谢谢?
赞一下 回复此楼
20楼2013-11-18 17:58:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dewdan

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-05 21:15:02
谢谢各位的建议，问题已经解决了

求解决方法啊 我也在做葡萄糖苷酶，但是测不出酶活
赞一下 回复此楼
21楼2013-11-20 09:41:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LostParasite

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-05 21:15:02
谢谢各位的建议，问题已经解决了

楼主你好，请问你是怎么解决糖苷酶没酶活的问题的呢？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
22楼2019-05-04 06:56:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LostParasite

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by dewdan at 2013-11-20 09:41:55
求解决方法啊 我也在做葡萄糖苷酶，但是测不出酶活...

你好，请问后来问题解决了吗？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
23楼2019-05-04 06:56:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

LostParasite

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 17:24:27
1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记得 ...

前辈，我也是做β糖苷酶工程菌的，同样诱导后没有酶活，卡在这步挺久了，望指点我一下。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
24楼2019-05-04 07:12:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

FPshuicao

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-05 21:15:02
谢谢各位的建议，问题已经解决了

前辈，我现在正在做β-葡萄糖醛酸苷酶的稳定性研究，但是酶稳定性很差，低浓度4℃条件下一天就降解失活了，有什么方法可以保持酶活性吗？
赞一下 回复此楼
25楼2019-05-21 19:57:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
harbor20105楼
2011-12-04 17:43   回复  
相关版块跳转 我要订阅楼主 Shinning123 的主题更新
251/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0854控制工程 359求调剂 可跨专业 +3 626776879 2026-03-14 9/450 2026-03-16 17:42 by 626776879
[考研] 0703化学调剂 +6 妮妮ninicgb 2026-03-15 9/450 2026-03-16 16:40 by houyaoxu
[考研] 070300化学学硕求调剂 +6 太想进步了0608 2026-03-16 6/300 2026-03-16 16:13 by kykm678
[考研] 0703化学调剂，求各位老师收留 +8 秋有木北 2026-03-14 8/400 2026-03-16 15:21 by 哦哦123
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +13 enenenhui 2026-03-13 14/700 2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 308求调剂 +3 是Lupa啊 2026-03-16 3/150 2026-03-16 10:07 by 求调剂zz
[基金申请] NSFC申报书里申请人简历中代表性论著还需要在申报书最后的附件里面再上传一遍吗 20+5 NSFC2026我来了 2026-03-10 14/700 2026-03-15 23:53 by 不负韶华的虎
[考博] 东华理工大学化材专业26届硕士博士申请 +6 zlingli 2026-03-13 6/300 2026-03-15 20:00 by ryzcf
[考研] 材料专硕326求调剂 +4 墨煜姒莘 2026-03-15 4/200 2026-03-15 11:02 by dyw
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 321求调剂 +3 CUcat 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:25 by JourneyLucky
[考研] 26考研调剂 +3 ying123. 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:18 by JourneyLucky
[考研] 2026考研调剂+本科延边大学+山东大学+生物化学与分子生物学+有项目经验 +3 ccdsscjy 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:12 by JourneyLucky
[考研] 332求调剂 +3 zjy101327 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:48 by JourneyLucky
[考研] 0703化学调剂 +4 快乐的香蕉 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:41 by JourneyLucky
[考研] 332求调剂 +3 Zz版 2026-03-13 3/150 2026-03-13 20:36 by 18595523086
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 290求调剂 +3 ADT 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:19 by peike
[考研] 哈工大材料324求调剂 +6 闫旭东 2026-03-10 8/400 2026-03-10 22:49 by 星空星月
[考研] 298求调剂 +3 Vv呀！ 2026-03-10 3/150 2026-03-10 22:40 by 剑诗杜康
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭