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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酵母表达可溶性蛋白问题
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sunyi_lab

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酵母表达可溶性蛋白问题

第一次发帖，如有错误，大家多多批评哈

   本人用酿酒酵母想表达一个转到PYES2里的目的基因，想表达出可溶蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳来看的结果，做了好多次都似有似无，求解决方法？还是因为酵母表达出来的蛋白量很小不易观察呢？
   
    刚开始做实验，好多不懂，希望大虾赐教！
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1楼2011-03-26 18:47:17
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
sunyi_lab(金币+1): 呵呵，谢谢，先去照一下 2011-03-27 08:21:05
楼主啊，“似有似无”的情况，能不能贴个电泳图片来看看？这样大家更容易帮你哦
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3楼2011-03-26 22:35:56
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sunyi_lab

银虫 (小有名气)

附上电泳图

实验是以未诱导的菌破碎蛋白作为空白对照，本人需要的蛋白应该在红色marker和下面的蓝色条带中间出现，可不知为什么感觉空白对照比诱导的还多了一条带，好奇怪。请各位大侠多多指教
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4楼2011-03-27 18:10:28
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
sunyi_lab(金币+5): 呵呵，谢谢啦 2011-03-30 07:26:10
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2011-05-05 17:35:22
酿酒酵母这个表达系统用的是组成型启动子，表达量一般情况下都不会很高，建议有tag的话，纯化或者做个western看看。
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5楼2011-03-28 22:53:27
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wangzhenheng

铜虫 (初入文坛)

请大侠们继续赐教

引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-03-28 22:53:27:
酿酒酵母这个表达系统用的是组成型启动子，表达量一般情况下都不会很高，建议有tag的话，纯化或者做个western看看。

有his tag，用试剂盒纯化后无明显条带，是量少的看不出来还是没有表达呢？因为要做酶活性，而酶活要用的底物比较贵，希望确证有蛋白后再做。
请问还有其它确证有否表达蛋白的方法吗？
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6楼2011-03-30 07:33:21
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susizheng

木虫 (著名写手)
sunyi_lab(金币+2): 谢谢 2011-04-14 08:52:08
引用回帖:
Originally posted by wangzhenheng at 2011-03-30 07:33:21:
有his tag，用试剂盒纯化后无明显条带，是量少的看不出来还是没有表达呢？因为要做酶活性，而酶活要用的底物比较贵，希望确证有蛋白后再做。
请问还有其它确证有否表达蛋白的方法吗？

可以先做个western吧，用his-taq的抗体，天根有的卖，效果还过得去。
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7楼2011-03-30 17:22:13
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yunzhongfan

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
sunyi_lab(金币+2): 谢谢回帖交流 2011-05-05 10:16:12
可以做RT-PCR先看看目的基因是否表达
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8楼2011-05-03 21:21:46
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sunyi_lab

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yunzhongfan at 2011-05-03 21:21:46:
可以做RT-PCR先看看目的基因是否表达

小妹刚开始做，不太懂，我的目的基因在质粒载体上，为什么要做反转录呢？大侠啥意思？具体怎样做？谢谢交流
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9楼2011-05-05 10:18:50
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yylc1840

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
毕赤酵母 是目的基因要插入到基因组里的，不知道酿酒酵母是不是
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10楼2012-06-11 21:31:12
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stlion223

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1274885楼: Originally posted by sunyi_lab at 2011-05-04 20:18:50
小妹刚开始做，不太懂，我的目的基因在质粒载体上，为什么要做反转录呢？大侠啥意思？具体怎样做？谢谢交流...

他是说让你看看目标基因有没有转录 我觉得一般情况下酵母的启动子比较好用 转录都没有问题
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11楼2012-06-12 11:14:29
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lijuan211715

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by susizheng at 2011-03-28 22:53:27
酿酒酵母这个表达系统用的是组成型启动子，表达量一般情况下都不会很高，建议有tag的话，纯化或者做个western看看。

请问你用的是哪个载体呢？
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12楼2013-06-19 16:15:25
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lxw_2010

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
凝胶电泳分辨率较低，用银染试试
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13楼2017-07-21 08:10:55
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k-li2楼
2011-03-26 20:05   回复  
sunyi_lab(金币+2): 谢谢支持，呵呵，请大家多多帮忙 2011-03-26 21:21:31
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