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torontogirl

铁虫 (初入文坛)

[求助] AMPK蛋白纯化问题讨论

我最近在做AMPK的蛋白纯化，用的是原核表达，诱导表达的大部分目的蛋白都是包涵体，小部分是可溶的。我就利用这小部分的可溶蛋白过了两次His亲和层析柱，纯化出来的纯度大概在85%以上，可惜在浓缩的时候出现大量沉淀（用超滤管浓缩），剩余的可溶性蛋白只有0.2-0.3mg/ml，我看文献中说AMPK蛋白在大于1mg/ml时容易出现聚集，但是我的蛋白浓度总是停留在0.2-0.3mg/ml的浓度，不知道怎么回事。另外跑电泳发现沉淀基本上都是我的目的蛋白，杂蛋白其实都还在溶液中。大家帮忙分析下原因，有什么好办法。谢谢啦。
另外也做AMPK蛋白方面实验的战友可以联系我哦。相互交流经验嘛。
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1楼 2011-11-15 15:31:39
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流！ 2011-11-15 18:53:06
torontogirl(金币+1): 避免局部浓度过高，谢谢你的建议 2011-11-16 21:27:36
你做的AMPK是人源的还是什么？我记得07年的时候酵母AMPK的结构已经解析了。放慢一点浓缩的离心力，离几分钟停下来将吸附在膜上的吹打下来，避免局部浓度过高造成的沉淀。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-11-15 18:31:57
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-15 18:31:57:
你做的AMPK是人源的还是什么？我记得07年的时候酵母AMPK的结构已经解析了。放慢一点浓缩的离心力，离几分钟停下来将吸附在膜上的吹打下来，避免局部浓度过高造成的沉淀。

大鼠源的，参照文献Dietbert Neumann etc. Mammalian AMP-activated protein kinase: functional,heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in Escherichia coli.Protein Expression and Purification 30 (2003) 230–237.的确，酵母的、人源的AMPK结构都已经解析出来了。我们目前发现一个小分子激动剂，想做蛋白与化合物结合的结构分析，当然这个是后话，现在先是想表达出一个有活性的蛋白而已。
可能按你说的结果能好些，不过我觉得很奇怪，我的可溶性蛋白浓度总是在0.2-0.3mg/ml，再怎么说浓缩了之后蛋白浓度应该升高了才对啊。我的buffer是：50mM Tris-HCl PH7.5, 1mM beta-巯基乙醇，1mM EDTA
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3楼2011-11-15 21:01:49
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

★ ★
torontogirl(金币+1): 加高浓度盐离子，谢谢你的建议。 2011-11-16 21:28:05
wanhscn(金币+2): 鼓励专家应助回帖! 2011-11-17 00:16:13
引用回帖:
3楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-15 21:01:49:
大鼠源的，参照文献Dietbert Neumann etc. Mammalian AMP-activated protein kinase: functional,heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in Escherichia coli.Protein Expression and Puri@ ...

我的buffer是：50mM Tris-HCl PH7.5, 1mM beta-巯基乙醇，1mM EDTA

我不太清楚你这个蛋白有什么特殊之处，对盐离子很敏感么？为何buffer的离子强度这么低？试过加100-300mM的NaCl没？
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2011-11-15 23:54:20
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allmessup

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): good 2011-11-17 19:06:46
引用回帖:
1楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-15 15:31:39:
我最近在做AMPK的蛋白纯化，用的是原核表达，诱导表达的大部分目的蛋白都是包涵体，小部分是可溶的。我就利用这小部分的可溶蛋白过了两次His亲和层析柱，纯化出来的纯度大概在85%以上，可惜在浓缩的时候出现大量沉 ...

LS说的有道理~~离子强度太低的确可能会导致蛋白质容易聚沉~
另外你可以看一下人源的那个文献的method部分，看看人家是使用了什么样的条件~
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Ipsascientiapotestasest.
5楼2011-11-16 00:06:17
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qwertY23

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

wanhscn: 不要直接在同一主题里一字不漏的引用别人的回帖，会增加冗余回帖！ 2011-11-16 10:00:06
wanhscn: 如同意5楼说法，可回复同意等字眼。否则容易形成剽窃之嫌！ 2011-11-16 10:01:37
LS说的有道理~~离子强度太低的确可能会导致蛋白质容易聚沉~
另外你可以看一下人源的那个文献的method部分，看看人家是使用了什么样的条件
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实验代做，技术服务，race，DGGE，wb，QPCR.流式及免疫组化
6楼2011-11-16 09:56:08
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-15 23:54:20:
我的buffer是：50mM Tris-HCl PH7.5, 1mM beta-巯基乙醇，1mM EDTA

我不太清楚你这个蛋白有什么特殊之处，对盐离子很敏感么？为何buffer的离子强度这么低？试过加100-300mM的NaCl没？

恩，我试过加500mM NaCl，效果能好些，但是我还想打质谱鉴定下我的蛋白分子量，高盐会有影响的。
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7楼2011-11-16 21:14:46
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qwertY23 at 2011-11-16 09:56:08:
LS说的有道理~~离子强度太低的确可能会导致蛋白质容易聚沉~
另外你可以看一下人源的那个文献的method部分，看看人家是使用了什么样的条件

可惜没有写那么细啦。
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8楼2011-11-16 21:26:30
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
引用回帖:
8楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-16 21:26:30:
可惜没有写那么细啦。

我看那篇文章引用次数还挺高的，你可以查查引用它的文章中有无详述。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
9楼2011-11-16 22:26:05
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-16 22:26:05:
我看那篇文章引用次数还挺高的，你可以查查引用它的文章中有无详述。

引用的文献就更不会写的详细了，我看了好多篇都是一笔带过的。
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10楼2011-11-17 15:50:11
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