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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 使用NOVAGEN的His-tag蛋白纯化柱出现的问题
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yeshui

铁虫 (小有名气)

[求助] 使用NOVAGEN的His-tag蛋白纯化柱出现的问题

我过柱子之后，在加elute之前的接样中出现了目的蛋白，但在加elute之后的接样中目的蛋白量很少，而且有杂带，为什么呢？还有就是该怎样清洗柱子呢,每一步中各物质的作用是什么呢？谢谢高人指点
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1楼 2011-07-27 09:24:38
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-30 13:22:28
没加洗脱液就有目的蛋白质，说明你的蛋白质没能被吸附，可能是填料没处理好，吸附状态不佳；标签被蛋白质折叠进结构内部，吸附不上；你的蛋白质样品中有咪唑？（这个估计不大可能）

洗脱液要设置洗脱梯度，咪唑浓度依次升高，例如20、50、100、150、200、500mM，一般在前面4个梯度就能洗脱完目的蛋白质了。也有可能这4个梯度都能洗脱下来目的蛋白质，那就同时看哪个洗脱液的比较纯。
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yeshui
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-07-27 09:54:26
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yeshui

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-27 09:54:26:
没加洗脱液就有目的蛋白质，说明你的蛋白质没能被吸附，可能是填料没处理好，吸附状态不佳；标签被蛋白质折叠进结构内部，吸附不上；你的蛋白质样品中有咪唑？（这个估计不大可能）

洗脱液要设置洗脱梯度，咪唑 ...

样品中没有咪唑啊，我的洗脱梯度是5mM 60mM 1M,那是不是柱子出问题了呢？
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3楼2011-07-27 10:18:32
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
5、60、1000mM跨度太大了

带有标签的蛋白质穿透了，要么是层析柱，要么是蛋白质标签被折叠进内部了
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4楼2011-07-27 10:22:57
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