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yeshui

铁虫 (小有名气)

[求助] 使用NOVAGEN的His-tag蛋白纯化柱出现的问题

我过柱子之后,在加elute之前的接样中出现了目的蛋白,但在加elute之后的接样中目的蛋白量很少,而且有杂带,为什么呢?还有就是该怎样清洗柱子呢,每一步中各物质的作用是什么呢?谢谢高人指点
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-30 13:22:28
没加洗脱液就有目的蛋白质,说明你的蛋白质没能被吸附,可能是填料没处理好,吸附状态不佳;标签被蛋白质折叠进结构内部,吸附不上;你的蛋白质样品中有咪唑?(这个估计不大可能)

洗脱液要设置洗脱梯度,咪唑浓度依次升高,例如20、50、100、150、200、500mM,一般在前面4个梯度就能洗脱完目的蛋白质了。也有可能这4个梯度都能洗脱下来目的蛋白质,那就同时看哪个洗脱液的比较纯。

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流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-07-27 09:54:26
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yeshui

铁虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-27 09:54:26:
没加洗脱液就有目的蛋白质,说明你的蛋白质没能被吸附,可能是填料没处理好,吸附状态不佳;标签被蛋白质折叠进结构内部,吸附不上;你的蛋白质样品中有咪唑?(这个估计不大可能)

洗脱液要设置洗脱梯度,咪唑 ...

样品中没有咪唑啊,我的洗脱梯度是5mM 60mM 1M,那是不是柱子出问题了呢?
3楼2011-07-27 10:18:32
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

5、60、1000mM跨度太大了

带有标签的蛋白质穿透了,要么是层析柱,要么是蛋白质标签被折叠进内部了
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-27 10:22:57
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