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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白纯化后透析及浓缩问题
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dudu1161

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】蛋白纯化后透析及浓缩问题

虫友们，大家好！请教大家一个问题，不胜感激。
    蛋白纯化时洗脱缓冲液为300 mM NaCl; 350 mM imidazole,50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0。因为后续实验要肠激酶切割，所以用肠激酶缓冲液来透析，但是透析过夜后沉淀。原因可能是透析缓冲液的pH值（7.4）与目的蛋白等电点(7.2)相差太近。
       然后用Amicon超滤离心管来除盐、浓缩，效果不好，可能也有操作不熟练问题，基本没有浓缩效果。
    所以还是想通过透析，冻干的方法来达到除盐、浓缩的目的，但是用肠激酶缓冲液的话又会沉淀，而且冻干后对溶液也有一个浓缩的效果。
    现在我有两种想法：
    一、将肠激酶缓冲液的pH值调到8.5，透析过夜，问题是冻干后会将蛋白所在缓冲液一起冻干浓缩；
    二、将超纯水的pH值调到8.5，透析过夜。
    不知虫友们有没有更好的解决方法，请虫友们不吝赐教，多谢大家！
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Stop walking today and you will have to run tomorrow!
1楼2010-08-25 15:48:02
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
★ ★
dudu1161(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-08-31 12:04:12
引用回帖:
Originally posted by dudu1161 at 2010-08-25 15:48:02:
虫友们，大家好！请教大家一个问题，不胜感激。
    蛋白纯化时洗脱缓冲液为300 mM NaCl; 350 mM imidazole,50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0。因为后续实验要肠激酶切割，所以用肠激酶缓冲液来透析，但是 ...

可以用pH8.0的buffer,然后调节至pH7.4.还有，你可以透析直接透析你的蛋白，然后加一点（0.1-0.5% saryksal，一种阴离子去垢剂）溶解你的蛋白，不过之前你要测试一下肠激酶在这种条件下有没有活性，
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2楼2010-08-25 17:00:57
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dudu1161

银虫 (小有名气)

多谢指点

引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-08-25 17:00:57:
可以用pH8.0的buffer,然后调节至pH7.4.还有，你可以透析直接透析你的蛋白，然后加一点（0.1-0.5% saryksal，一种阴离子去垢剂）溶解你的蛋白，不过之前你要测试一下肠激酶在这种条件下有没有活性，

感谢指点，因为实验室没有 saryksal，所以我就用1*肠激酶缓冲液透析（调节pH至8.4），对照组是0.01*肠激酶缓冲液透析（调节pH至8.4），结果透析过夜后1*沉淀，0.01*未沉淀，不知道这其中的原因是什么？
冻干后加水，蛋白很难溶解，像是悬浊液般没有完全溶解。
请多多指教，多谢！
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Stop walking today and you will have to run tomorrow!
3楼2010-08-29 11:43:47
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
dudu1161(金币+3): 2010-08-31 09:37:26
引用回帖:
Originally posted by dudu1161 at 2010-08-29 11:43:47:


感谢指点，因为实验室没有 saryksal，所以我就用1*肠激酶缓冲液透析（调节pH至8.4），对照组是0.01*肠激酶缓冲液透析（调节pH至8.4），结果透析过夜后1*沉淀，0.01*未沉淀，不知道这其中的原因是什么？
冻干 ...

这个我也有点困惑，50nM的NACL是不会引起蛋白沉淀的。你考虑下纯化好蛋白，在加咪唑之前直接将柱料加入肠激酶的buffer，然后加入肠激酶，之后离心去除His-tag，你试过没有
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4楼2010-08-29 14:34:00
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dudu1161

银虫 (小有名气)

方法很好 值得一试

引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-08-29 14:34:00:

这个我也有点困惑，50nM的NACL是不会引起蛋白沉淀的。你考虑下纯化好蛋白，在加咪唑之前直接将柱料加入肠激酶的buffer，然后加入肠激酶，之后离心去除His-tag，你试过没有

感觉您说的方法很妙 也省了不少步骤 这样就是蛋白的浓度无法确定 肠激酶也不知加多少才好 那就根据之前的经验值做吧 今天正好做纯化 可以小量试一下 多谢指点 希望能继续交流
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5楼2010-08-31 09:42:57
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dudu1161

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-08-29 14:34:00:

这个我也有点困惑，50nM的NACL是不会引起蛋白沉淀的。你考虑下纯化好蛋白，在加咪唑之前直接将柱料加入肠激酶的buffer，然后加入肠激酶，之后离心去除His-tag，你试过没有

其实，我感觉最大的问题就是肠激酶缓冲液的pH值（7.4）与目的蛋白等电点(7.22)相差太近，这样就容易产生沉淀。
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6楼2010-08-31 10:03:43
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
dudu1161(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+4): Good！哥们很犀利啊！ 2011-12-13 19:05:30
引用回帖:
1楼: Originally posted by dudu1161 at 2010-08-25 15:48:02:
虫友们，大家好！请教大家一个问题，不胜感激。
    蛋白纯化时洗脱缓冲液为300 mM NaCl; 350 mM imidazole,50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0。因为后续实验要肠激酶切割，所以用肠激酶缓冲液来透析，但是 ...

咪唑是否影响你后期的实验？？？

如果不影响问题就变得简单了很多。
elution buffer 直接使用你后期反应buffer，加入咪唑。连洗脱带换buffer一步完成，需要浓度高一些的话就表达大量蛋白挂在柱子上，用少量的buffer洗脱。你要知道亲和层析过程除了纯化话另外一个作用就是浓缩！
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7楼2011-12-13 17:08:35
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laokuang1988

铜虫 (小有名气)
★
dudu1161(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
2009247楼: Originally posted by sqhnsd at 2010-08-29 14:34:00
这个我也有点困惑，50nM的NACL是不会引起蛋白沉淀的。你考虑下纯化好蛋白，在加咪唑之前直接将柱料加入肠激酶的buffer，然后加入肠激酶，之后离心去除His-tag，你试过没有...

我也在做这个实验，我想问纯化好的蛋白不是已经有了咪唑吗
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8楼2012-06-08 16:36:06
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风影一生

新虫 (正式写手)
★
dudu1161(金币+1): 谢谢参与
有条件的话过一次分子筛，既除盐又除小分子杂质，体积大一点也没关系，反正最后你还要冻干
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9楼2013-08-20 09:14:13
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