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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近纯化融合蛋白，请问透析需要加PMSF吗？
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btx362237729

金虫 (正式写手)

[求助] 最近纯化融合蛋白，请问透析需要加PMSF吗？

以前没纯化过蛋白，听说透析的时候要加PMSF，我查了一下PMSF是抑制蛋白酶的，应该是防止目的蛋白被降解咯。。。。。

而且PMSF有剧毒啊。。。

请问PMSF的量应该是加多少啊？
还有透析的时间大概是多长啊？

谢谢大家
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人生最黑暗的时光终于过去了
1楼2011-07-30 20:22:31
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励下 2011-07-30 23:32:23
你的宿主是不是蛋白酶缺陷型的？

透析时间要看透析效果，透析之后测定一下透析液的电导率，如果还高就换液继续透析。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-07-30 21:20:22
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-30 21:20:22:
你的宿主是不是蛋白酶缺陷型的？

透析时间要看透析效果，透析之后测定一下透析液的电导率，如果还高就换液继续透析。

并不是蛋白酶缺陷型的。。。。。但是我们发现菌体超声裂解后 上清放一段时间了（-20℃）蛋白的量还是很多

导电率要怎么测
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人生最黑暗的时光终于过去了
3楼2011-07-30 21:23:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
电导率有仪器测的，如果你没有，就换多几次透析液。

我没加过那东西。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-30 21:33:57
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-30 21:33:57:
电导率有仪器测的，如果你没有，就换多几次透析液。

我没加过那东西。

一同学说以前加过 我再问问他
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人生最黑暗的时光终于过去了
5楼2011-07-30 21:36:35
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-07-30 23:05:53
btx362237729(金币+2): 非常感谢哦。。。。。但是过夜透析怎么换液，，，半夜换啊 2011-07-31 12:53:14
引用回帖:
Originally posted by btx362237729 at 2011-07-30 20:22:31:
以前没纯化过蛋白，听说透析的时候要加PMSF，我查了一下PMSF是抑制蛋白酶的，应该是防止目的蛋白被降解咯。。。。。

而且PMSF有剧毒啊。。。

请问PMSF的量应该是加多少啊？
还有透析的时间大概是多 ...

PMSF是丝氨酸蛋白酶的专一性抑制剂，主要是防止目的蛋白在纯化的过程中被降解。
PMSF虽然有毒，但操作过程中戴手套，操作过程中小心一点，没有问题的。

PMSF的用量很少，以前我的实验结果表明1mM浓度的PMSF就可以抑制住丝氨酸蛋白酶的活性。

透析的时间一般是7-8个小时，也可以过夜透析，如果蛋白容易变性，最好在冰浴或4度透析，透析缓冲液要换3-4次。
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6楼2011-07-30 21:57:52
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)
不需要半夜换透析液，在睡觉前换就可以了，透析液中离子交换比较频繁的时候是透析的前面阶段！
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7楼2011-07-31 12:59:03
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jinkui960 at 2011-07-31 12:59:03:
不需要半夜换透析液，在睡觉前换就可以了，透析液中离子交换比较频繁的时候是透析的前面阶段！

最后请教一下 透析液就是纯水么 灭过菌的
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人生最黑暗的时光终于过去了
8楼2011-07-31 13:07:52
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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by btx362237729 at 2011-07-31 13:07:52:
最后请教一下 透析液就是纯水么 灭过菌的

一般来说，透析液应该是缓冲液，因为有些蛋白在纯水中容易变性。

主要看你的蛋白溶解在那种缓冲液（溶液）中，这种缓冲液就可以作为你的透析液。
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9楼2011-07-31 13:13:22
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jinkui960 at 2011-07-31 13:13:22:
一般来说，透析液应该是缓冲液，因为有些蛋白在纯水中容易变性。

主要看你的蛋白溶解在那种缓冲液（溶液）中，这种缓冲液就可以作为你的透析液。

但是缓冲液中有Tris 有EDTA。。。透析就是为了除掉这些盐。。。肯定不能用缓冲液啊
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人生最黑暗的时光终于过去了
10楼2011-07-31 13:16:43
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