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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于Ni-NTA纯化蛋白
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rsgd1990

银虫 (初入文坛)

[交流] 关于Ni-NTA纯化蛋白 已有7人参与

我在实验室纯化一个蛋白，超声波破碎菌体后离心，将上清液过柱子，bindbuffer 的咪唑为10mM,wash buffer 的咪唑为20mM和100mM,elutebuffer 的咪唑为250mM，ph都是8。最后蛋白没有洗下来，还在柱子上。
于是我加大elutebuffer的咪唑浓度，变为400mM,结果还是洗不下来。
老师就让我降低ph试试，今天我把ph调到6.5，但还是不行，明天打算降到5.5试试。

各位有没有遇到这种情况的？是不是ph的原因啊？
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1楼 2012-02-17 23:04:41
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会飞的害虫

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+4): Good！ 2012-02-18 21:49:58
正常来说不会是PH值的问题
1.确定有可溶蛋白存在上清液中；
2.蛋白确实挂柱了；
3.检测过洗涤液中的蛋白（正常来说，洗涤液咪唑不会超过50,100很多蛋白已经洗走）
如果以上三条都确认了，建议柱子再生，所有溶液重新配一次。
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不是没有，而是你看不见。
2楼2012-02-18 11:30:40
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873801800

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你用的都是自己配的buffer呗？我用的试剂盒，结果也是什么都没有，不知道为什么，你的上清液上样量是多少呀？
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3楼2012-02-18 20:12:13
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jingzhang08

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
有没有看flow through里面有没有啊，就是有没有确实挂在柱子上啊
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4楼2012-02-19 22:44:34
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jingzhang08

新虫 (初入文坛)
要不要加点盐试试？
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5楼2012-02-19 22:46:17
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rsgd1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by jingzhang08 at 2012-02-19 22:44:34:
有没有看flow through里面有没有啊，就是有没有确实挂在柱子上啊

上清液过两次柱子，每次后的滤液也都取了跑PAGE，显示滤液中还有少量的目的蛋白，但我将柱子重悬后取出跑PAGE，显示柱子上有很多目的蛋白。
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6楼2012-02-19 23:14:28
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rsgd1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 873801800 at 2012-02-18 20:12:13:
你用的都是自己配的buffer呗？我用的试剂盒，结果也是什么都没有，不知道为什么，你的上清液上样量是多少呀？

都是自己配的，上样量是7ml吧
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7楼2012-02-19 23:15:13
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jingzhang08

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by rsgd1990 at 2012-02-19 23:14:28:
上清液过两次柱子，每次后的滤液也都取了跑PAGE，显示滤液中还有少量的目的蛋白，但我将柱子重悬后取出跑PAGE，显示柱子上有很多目的蛋白。

都死在柱子上了…
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8楼2012-02-20 10:10:34
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merckten123

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+2): 鼓励新虫回帖，蛮有道理的 2012-02-20 13:40:23
LZ用的是默克 NOVAGEN的纯化试剂盒吗？可以打技术支持问问。
之前我们做的时候是一直出现一个咋带，就是不管纯化什么蛋白都有，后来打客服的
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9楼2012-02-20 13:19:31
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rsgd1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by jingzhang08 at 2012-02-20 10:10:34:
都死在柱子上了…

那怎么办啊
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10楼2012-02-20 21:34:10
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