关于Ni-NTA纯化蛋白 - 分子生物 - 综合其他 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

11楼2012-02-20 21:39:00

873801800

铜虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 98.5
帖子: 19
在线: 24.1小时
虫号: 1224365
注册: 2011-03-07
性别: MM
专业: 食品科学基础

引用回帖:

7楼: Originally posted by rsgd1990 at 2012-02-19 23:15:13:
都是自己配的，上样量是7ml吧

带培养基的菌液用了多少呢

12楼2012-02-20 21:40:22

jingzhang08

新虫 (初入文坛)

应助: 5 (幼儿园)
金币: 45.3
帖子: 26
在线: 3.6小时
虫号: 1377398
注册: 2011-08-23
专业: 生物大分子结构与功能

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖

引用回帖:

10楼: Originally posted by rsgd1990 at 2012-02-20 21:34:10:
那怎么办啊

我们组的蛋白也有过这情况，没有试图去洗下来，是对蛋白本身做了优化
它现在死在镍柱上，将来gel filtration也有可能死在柱子上

13楼2012-02-21 14:46:30

rsgd1990

银虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 397.5
散金: 16
帖子: 34
在线: 84.2小时
虫号: 1145888
注册: 2010-11-13
性别: GG
专业: 传染病流行病学

引用回帖:

楼: Originally posted by 873801800 at 2012-02-20 21:40:22:
带培养基的菌液用了多少呢

40ml菌液离心，菌体用7ml PBS 重悬，超声波破碎的

14楼2012-02-21 16:14:05

rsgd1990

银虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 397.5
散金: 16
帖子: 34
在线: 84.2小时
虫号: 1145888
注册: 2010-11-13
性别: GG
专业: 传染病流行病学

引用回帖:

楼: Originally posted by jingzhang08 at 2012-02-21 14:46:30:
我们组的蛋白也有过这情况，没有试图去洗下来，是对蛋白本身做了优化
它现在死在镍柱上，将来gel filtration也有可能死在柱子上

能具体说一下具体哪方面的优化吗

15楼2012-02-21 16:15:07

jingzhang08

新虫 (初入文坛)

应助: 5 (幼儿园)
金币: 45.3
帖子: 26
在线: 3.6小时
虫号: 1377398
注册: 2011-08-23
专业: 生物大分子结构与功能

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖

引用回帖:

15楼: Originally posted by rsgd1990 at 2012-02-21 16:15:07:
能具体说一下具体哪方面的优化吗

我也只是一个本科生，遇到的这样情况也不是很多
死在柱子上就可能是表达的蛋白性质本身不好，不是well-folded;
像我们那个蛋白就N-His tag就不好，换到C-His tag就好了，就觉得这个也没啥规律，我也不能在这里误导你，毕竟我经验不多；也听说过别人的一些情况，用高盐把蛋白洗下来，再慢慢去除盐，但这样子后面证明也不太来，毕竟是蛋白的性质就是不太好。
我真的不能多说，万一说错了不害人嘛，希望真正的行家来帮助你，bless！

16楼2012-02-22 13:28:16

873801800

铜虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 98.5
帖子: 19
在线: 24.1小时
虫号: 1224365
注册: 2011-03-07
性别: MM
专业: 食品科学基础

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖

引用回帖:

14楼: Originally posted by rsgd1990 at 2012-02-21 16:14:05:
40ml菌液离心，菌体用7ml PBS 重悬，超声波破碎的

再浓缩一下试试呢我今天100mL菌液，4ml加6M尿素的bind buffer 上样的似乎纯化出来了

17楼2012-02-22 21:43:59

edoz1986

新虫 (小有名气)

应助: 20 (小学生)
金币: 300.5
红花: 9
帖子: 206
在线: 64.9小时
虫号: 986360
注册: 2010-03-31
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

两个方略
1: 加EDTA洗脱，连带ni一块洗下来
2：你的蛋白比较容易挂柱，建议上样buffer 加0.5M nacl 快速上样，再试试

18楼2013-05-23 14:57:59

wacx33

禁虫 (小有名气)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

本帖内容被屏蔽

19楼2013-05-23 15:11:21

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

专家经验: +218
MolEPI: 44
应助: 397 (硕士)
贵宾: 0.044
金币: 2118.9
散金: 10
红花: 208
帖子: 5633
在线: 571.6小时
虫号: 1766465
注册: 2012-04-19
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能
管辖: 生物科学综合

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

若确定没有洗脱下来，请依次检查：
1.洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）
解决方法：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
2.降低PH的方法洗脱的,因为若pH低于3.5,会导致镍离子脱落
解决方法：改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱
3.蛋白已沉淀在柱上
解决方法：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。
4.可能原因：非特异性疏水或其他相互反应
解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。

以上方法都不灵，那么只能重新设计His尾：1.适当减少His尾中的His残基的数量；2.His尾与蛋白质本体之间构建专一性的酶切位点，比如凝血酶位点，注意：His尾与蛋白质本体之间要留下5-6个亲水的氨基酸片段，以防止引起蛋白质异常折叠和遮盖酶切位点。

20楼2014-07-17 01:00:51