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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于Ni-NTA纯化蛋白
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873801800

铜虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by merckten123 at 2012-02-20 13:19:31:
LZ用的是默克 NOVAGEN的纯化试剂盒吗？可以打技术支持问问。
之前我们做的时候是一直出现一个咋带，就是不管纯化什么蛋白都有，后来打客服的

客服帮助解决好了吗？我也是用默克的试剂盒，什么都纯化不出来
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11楼2012-02-20 21:39:00
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873801800

铜虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by rsgd1990 at 2012-02-19 23:15:13:
都是自己配的，上样量是7ml吧

带培养基的菌液用了多少呢
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12楼2012-02-20 21:40:22
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jingzhang08

新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by rsgd1990 at 2012-02-20 21:34:10:
那怎么办啊

我们组的蛋白也有过这情况，没有试图去洗下来，是对蛋白本身做了优化
它现在死在镍柱上，将来gel filtration也有可能死在柱子上
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13楼2012-02-21 14:46:30
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rsgd1990

银虫 (初入文坛)
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楼: Originally posted by 873801800 at 2012-02-20 21:40:22:
带培养基的菌液用了多少呢

40ml菌液离心，菌体用7ml PBS 重悬，超声波破碎的
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14楼2012-02-21 16:14:05
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rsgd1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by jingzhang08 at 2012-02-21 14:46:30:
我们组的蛋白也有过这情况，没有试图去洗下来，是对蛋白本身做了优化
它现在死在镍柱上，将来gel filtration也有可能死在柱子上

能具体说一下具体哪方面的优化吗
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15楼2012-02-21 16:15:07
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jingzhang08

新虫 (初入文坛)
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15楼: Originally posted by rsgd1990 at 2012-02-21 16:15:07:
能具体说一下具体哪方面的优化吗

我也只是一个本科生，遇到的这样情况也不是很多
死在柱子上就可能是表达的蛋白性质本身不好，不是well-folded;
像我们那个蛋白就N-His tag就不好，换到C-His tag就好了，就觉得这个也没啥规律，我也不能在这里误导你，毕竟我经验不多；也听说过别人的一些情况，用高盐把蛋白洗下来，再慢慢去除盐，但这样子后面证明也不太来，毕竟是蛋白的性质就是不太好。
我真的不能多说，万一说错了不害人嘛，希望真正的行家来帮助你，bless！
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16楼2012-02-22 13:28:16
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873801800

铜虫 (初入文坛)
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14楼: Originally posted by rsgd1990 at 2012-02-21 16:14:05:
40ml菌液离心，菌体用7ml PBS 重悬，超声波破碎的

再浓缩一下试试呢 我今天100mL菌液，4ml加6M尿素的bind buffer 上样的 似乎纯化出来了
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17楼2012-02-22 21:43:59
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edoz1986

新虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
两个方略
1: 加EDTA洗脱，连带ni一块洗下来
2：你的蛋白比较容易挂柱，建议上样buffer 加0.5M nacl 快速上样，再试试
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18楼2013-05-23 14:57:59
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wacx33

禁虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
19楼2013-05-23 15:11:21
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
若确定没有洗脱下来，请依次检查：
1.洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）
解决方法：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
2.降低PH的方法洗脱的,因为若pH低于3.5,会导致镍离子脱落
解决方法：改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱
3.蛋白已沉淀在柱上
解决方法：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。
4.可能原因：非特异性疏水或其他相互反应
解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。

以上方法都不灵，那么只能重新设计His尾：1.适当减少His尾中的His残基的数量；2.His尾与蛋白质本体之间构建专一性的酶切位点，比如凝血酶位点，注意：His尾与蛋白质本体之间要留下5-6个亲水的氨基酸片段，以防止引起蛋白质异常折叠和遮盖酶切位点。
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20楼2014-07-17 01:00:51
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