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rsgd1990银虫 (初入文坛)
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[交流]
关于Ni-NTA纯化蛋白 已有7人参与
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我在实验室纯化一个蛋白，超声波破碎菌体后离心，将上清液过柱子，bindbuffer 的咪唑为10mM,wash buffer 的咪唑为20mM和100mM,elutebuffer 的咪唑为250mM，ph都是8。最后蛋白没有洗下来，还在柱子上。 于是我加大elutebuffer的咪唑浓度，变为400mM,结果还是洗不下来。 老师就让我降低ph试试，今天我把ph调到6.5，但还是不行，明天打算降到5.5试试。 各位有没有遇到这种情况的？是不是ph的原因啊？ |
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若确定没有洗脱下来，请依次检查： 1.洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强） 解决方法：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。 2.降低PH的方法洗脱的,因为若pH低于3.5,会导致镍离子脱落 解决方法：改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱 3.蛋白已沉淀在柱上 解决方法：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。 4.可能原因：非特异性疏水或其他相互反应 解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。 以上方法都不灵，那么只能重新设计His尾：1.适当减少His尾中的His残基的数量；2.His尾与蛋白质本体之间构建专一性的酶切位点，比如凝血酶位点，注意：His尾与蛋白质本体之间要留下5-6个亲水的氨基酸片段，以防止引起蛋白质异常折叠和遮盖酶切位点。 |
20楼2014-07-17 01:00:51
2楼2012-02-18 11:30:40
873801800
铜虫 (初入文坛)
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