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rsgd1990

银虫 (初入文坛)

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[交流] 关于Ni-NTA纯化蛋白已有7人参与

我在实验室纯化一个蛋白，超声波破碎菌体后离心，将上清液过柱子，bindbuffer 的咪唑为10mM,wash buffer 的咪唑为20mM和100mM,elutebuffer 的咪唑为250mM，ph都是8。最后蛋白没有洗下来，还在柱子上。
于是我加大elutebuffer的咪唑浓度，变为400mM,结果还是洗不下来。
老师就让我降低ph试试，今天我把ph调到6.5，但还是不行，明天打算降到5.5试试。

各位有没有遇到这种情况的？是不是ph的原因啊？

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1楼 2012-02-17 23:04:41

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凌波丽

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若确定没有洗脱下来，请依次检查：
1.洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）
解决方法：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
2.降低PH的方法洗脱的,因为若pH低于3.5,会导致镍离子脱落
解决方法：改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱
3.蛋白已沉淀在柱上
解决方法：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。
4.可能原因：非特异性疏水或其他相互反应
解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。

以上方法都不灵，那么只能重新设计His尾：1.适当减少His尾中的His残基的数量；2.His尾与蛋白质本体之间构建专一性的酶切位点，比如凝血酶位点，注意：His尾与蛋白质本体之间要留下5-6个亲水的氨基酸片段，以防止引起蛋白质异常折叠和遮盖酶切位点。