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rsgd1990

银虫 (初入文坛)

[交流] 关于Ni-NTA纯化蛋白已有7人参与

我在实验室纯化一个蛋白,超声波破碎菌体后离心,将上清液过柱子,bindbuffer 的咪唑为10mM,wash buffer 的咪唑为20mM和100mM,elutebuffer 的咪唑为250mM,ph都是8。最后蛋白没有洗下来,还在柱子上。
于是我加大elutebuffer的咪唑浓度,变为400mM,结果还是洗不下来。
老师就让我降低ph试试,今天我把ph调到6.5,但还是不行,明天打算降到5.5试试。

各位有没有遇到这种情况的?是不是ph的原因啊?
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jingzhang08

新虫 (初入文坛)

要不要加点盐试试?
5楼2012-02-19 22:46:17
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会飞的害虫

铜虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+4): Good! 2012-02-18 21:49:58
正常来说不会是PH值的问题
1.确定有可溶蛋白存在上清液中;
2.蛋白确实挂柱了;
3.检测过洗涤液中的蛋白(正常来说,洗涤液咪唑不会超过50,100很多蛋白已经洗走)
如果以上三条都确认了,建议柱子再生,所有溶液重新配一次。
不是没有,而是你看不见。
2楼2012-02-18 11:30:40
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873801800

铜虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
你用的都是自己配的buffer呗?我用的试剂盒,结果也是什么都没有,不知道为什么,你的上清液上样量是多少呀?
3楼2012-02-18 20:12:13
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jingzhang08

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
有没有看flow through里面有没有啊,就是有没有确实挂在柱子上啊
4楼2012-02-19 22:44:34
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